Novel murine glioblastoma models that reflect the immunotherapy resistance profile of a human disease

Chao-Hsien Chen and others

Neuro-Oncology, Volume 25, Issue 8, August 2023, Pages 1415–1427, doi: 10.1093/neuonc/noad025

目前免疫治疗广泛应用的小鼠模型GL261，具有高度免疫敏感性，PD-1阻断剂治疗的临床前研究结果令人鼓舞，但GBM患者阻断PD-1的临床试验并未显示疗效提高。另一免疫研究动物模型SB28，是通过转座子介导的基因转染，过度表达癌基因（如NRAS、PDGF)和下调抑癌基因TP53而产生，对PD-1和CTLA-4阻断有抗性；尽管具有耐药性，但突变异质性与由特定癌基因驱动的工程小鼠模型相似，突变更集中在某些通路上。因此，缺乏模仿人类疾病免疫生物学的小鼠胶质母细胞瘤模型阻碍了基础和转化免疫学研究的进展。说明需要新的、可靠的动物模型，以更准确反映人类疾病的免疫构成与治疗反应。

使用RCAS/Ntv-a系统改造的小鼠在原位自发发展成胶质母细胞瘤，除了驱动癌基因(如PDGF-，BCL-2)外，几乎不需要任何基因“二次攻击”，可能缺乏在人类疾病中存在的免疫靶向突变。因此，我们开发了源自Nestin-CreERT2 QkL/L; Trp53L/L; PtenL/L (QPP)小鼠的胶质母细胞瘤干细胞系，携带了人类胶质母细胞瘤中常见的临床相关遗传突变。

本研究旨在确定这些QPP细胞系在正常免疫功能宿主体内的免疫敏感性及其基本机制。将QPP系列细胞株接种在未予干预、抗PD-1或抗CTLA-4处理的小鼠的大脑和腋下腹侧皮下，进行差异性反应评估。通过全外显子测序测量每类肿瘤基因组对免疫响应的改变。利用流式细胞检测，比较敏感型(QPP7)和耐药型(QPP8)肿瘤在大脑中的免疫微环境改变。还测量了QPP8在腹侧皮下组织呈现敏感性和在大脑组织呈现耐药性的差异驱动因素。最终得出：①四株QPP细胞系几乎不表达T细胞检查点配体，如PD-L1或PD-L2，但在干扰素的刺激下，所有QPP细胞系PD-L1上调至中\高水平。QPP7也具有最高水平的诱导性PD-L1表达，表明对PD(L)-1阻断潜在敏感。②QPP7肿瘤系证明对PD-1阻断高敏感，QPP4和QPP5对抗PD -1治疗具有耐药性，QPP4和QPP8肿瘤对ICB有耐药性。QPP5和QPP7对CTLA-4阻断有反应。③无论植入部位如何，CD45+免疫细胞对CTLA-4或PD-1阻断的反应相似，这表明免疫抑制主要为保守机制，GR-MDSC也是QPP8中最少的髓系群体。④尽管脑QPP8对ICB治疗无效，但皮下QPP8肿瘤中CD8 T细胞频率显著增加，且肿瘤相关巨噬细胞(TAM)水平不会下降。⑤在抗CTLA-4和抗PD -1治疗的侧腹QPP8中CD8 T细胞相对于Treg的比率显著提高，随着CD8 T细胞浸润和Treg消耗的增加，产生比大脑中更强的促炎症性ICB反应。⑥ICB能够重塑QPP8皮下肿瘤（而不是大脑）的细胞组成（CD8 T细胞相对于抑制性骨髓基质细胞的比率升高，CD8 T细胞与粒细胞MDSC（GR-MDSC）的比率有所改善），从而有利于肿瘤免疫，这解释了QPP8免疫治疗在大脑中的抵抗。 ⑦在检查点封锁后，T细胞在皮下QPP8肿瘤中会扩增，而在大脑中则保持静止甚至下降。这表明大脑中存在额外显性T细胞增殖抑制机制，或检查点抗体一旦到达QPP8 TME就不再保护T细胞。⑧在皮下和脑QPP8肿瘤的髓质间质中，ICB触发PD-L1上调，该作用在脑中更显著，这可能是该部位免疫治疗耐药性的原因之一。⑨免疫敏感的QPP7相对于免疫耐药的QPP8具有更高的预测性新抗原负荷，通过TCR测序，QPP7中CD4 T细胞的TCR丰富度显著高于QPP8，在抗CTLA-4或抗PD-1阻断治疗后，预治疗的CD4 TCR丰富度与治疗结果更佳相关，而CD8 TCR丰富度则无显著差异。⑩QPP7是最具侵略性的肿瘤细胞系也是最敏感的免疫治疗细胞系。QPP7在脑部显示出免疫抑制型TME的特征，CD8 T细胞与抑制性基质的比例上升，髓样基质中精氨酸酶高表达，及ICB反应中PD-L1的适度诱导通常能加速肿瘤发生和侵袭，但这种较高的突变率和新抗原负荷也能产生更多样化且具有更高亲和力的抗肿瘤T细胞反应。

总之，我们相信，这些QPP模型提供了人类胶质母细胞瘤的免疫生物学的最准确反映，并将有助于推进有效的免疫治疗干预进入临床实践。

Novel INHAT repressor drives glioblastoma growth by promoting ribosomal DNA transcription in glioma stem cells

Weiwei Tao and others

Neuro-Oncology, Volume 25, Issue 8, August 2023, Pages 1428–1440,doi: 10.1093/neuonc/noac272 

小鼠胶质母细胞瘤模型缺乏类似人类免疫生物学特征，这阻碍了免疫学的基础和转化研究。因此，我们开发了QPP小鼠来源的小鼠胶质母细胞瘤干细胞细胞系。QPP小鼠带有临床常见有意义的基因突变Nestin-CreCRT2QkL/L，Trp53L/L，PtenL/L。本研究旨在确定这些QPP细胞系在免疫正常宿主上的免疫敏感性及其潜在机制。QPP细胞系与C57BL/6J小鼠基因同源，我们分别将QPP细胞系种植在小鼠的脑部和腹部，分析未治疗组、抗PD-1组和抗CTLA-4治疗组肿瘤对治疗的反应性。采用全外显子测序分析不同基因型对肿瘤对免疫治疗反应性的影响。采用流式细胞技术比较脑中免疫敏感（QPP7）和免疫抵抗（QPP8）细胞系的免疫微环境。另外还探讨了QPP8在腹部和在脑中免疫抵抗的机制。

QPP细胞系对T细胞免疫检查点阻断治疗的敏感度不一。从完全反应到完全抵抗。对免疫抵抗细胞株QPP8的肿瘤浸润免疫分析显示注射到皮下者T细胞健康度和效应细胞/抑制细胞比值较高（对治疗敏感），而注射到脑内的没有（治疗抵抗）。在髓系基质中PD-L1的普遍上调导致脑中的这一免疫豁免状态。而免疫敏感细胞株QPP7即使在脑中也对免疫检查点治疗反应良好，其原因可能是此细胞系中的新抗原负荷较高。

这些同源基因QPP胶质母细胞瘤模型呈现出了和临床类似的不同的免疫治疗敏感性，这对进一步的机制研究和评价免疫治疗效果均有潜在应用价值。

The development of a rapid patient-derived xenograft model to predict chemotherapeutic drug sensitivity/resistance in malignant glial tumors 

Martine Charbonneau and others

Neuro-Oncology, Volume 25, Issue 9, September 2023, Pages 1605–1616, doi: /10.1093/neuonc/noad047

高级别胶质瘤（HGG）是一种侵袭性脑肿瘤，患者的生存率低且对治疗的反应有限。虽然小鼠的患者来源的异种移植（PDX）模型为个体化治疗提供了可能性，但由于某些人类移植物的培养困难和肿瘤生长的时间较长，因此它们对HGG的应用受到限制。在这项研究中，研究人员使用了一种快速高效的鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）培养系统来评估HGG患者的肿瘤药物效果。作者选取了手术切除的少突胶质细胞瘤、星形细胞瘤和胶质母细胞瘤的新鲜组织，将组织切成直径在1到2毫米之间的碎片，并在CAM上再培养6到7天，值得注意的是，60名患者中的59名的胶质瘤组织在仅7天内成功移植到CAM上，成功率达到98.3%。这些CAM异种移植物在组织学和分子特征上都与原始肿瘤相似，作者对CAM模型进行了全外显子测序，发现癌症驱动的突变在CAM模型中很好地保留，随后作者通过CAM-胶质瘤试验有效地测试了肿瘤对特定药物如替莫唑胺和卡铂的反应，并且作者评估了CAM-PDX模型的致瘤性与患者临床结果之间的一致性，发现此模型形成肿瘤的能力与患者的不良预后相关。在涉及14名HGG患者的后续研究中，发现CAM异种移植物的药物反应与患者的临床反应完全匹配。总之，CAM-胶质瘤模型提供了一种快速和可靠的方法，作为药物研究的补充工具和实时预测HGG患者最有效治疗策略的平台，具有很大的潜力。

Non-metabolic functions of phosphofructokinase-1 orchestrate tumor cellular invasion and genome maintenance under bevacizumab therapy 

Yi Chieh Lim , Kamilla E Jensen, Diana Aguilar-Morante , Lina Vardouli , Kristoffer Vitting-Seerup …

Neuro Oncol. 2023 Feb 14;25(2):248-260. doi: 10.1093/neuonc/noac135.

胶质母细胞瘤(GBM)是一种高度致命的恶性肿瘤，新生血管生成是其特征性标志。抗VEGF抗体贝伐单抗已被批准用于治疗复发性GBM，但耐药性普遍存在。 我们研究发现，贝伐单抗可诱导GBM代谢向糖酵解转变，磷酸果糖激酶（PFK）家族成员能够调节糖酵解促进肿瘤生长，从而增强GBM细胞的侵袭能力。PFKM是PFK-1的一种肌肉特异性同工酶，调控糖酵解代谢的第一步。我们确定PFKM是GBM中贝伐单抗耐药的驱动因素，因为其非代谢功能促进肿瘤侵袭及稳定基因组。

PFKM功能及作用机制：①在细胞质中，PFKM结合并稳定KIF11分子，以驱动GBM增殖和侵袭；当敲除PFKM基因后，可诱导蛋白酶体介导的KIF11蛋白降解，导致细胞骨架组装和有丝分裂受阻。②在细胞核中，PFKM通过与NBS1相互作用，能够保护GBM免受基因组不稳定和细胞凋亡\死亡的影响；在PFKM基因敲除后，DNA损伤修复(DDR)通路被削弱，使GBM细胞对电离辐射的敏感性增加。③相关实验表明，上述两种PFKM缺失相关的表型作用与其代谢活性无关。④布比卡因可介导PFKM表型缺失，降低PFKM和KIF11蛋白的表达，诱导应激纤维的形成，并损害GBM细胞的迁移潜能。 布比卡因单药治疗降低了核分裂指数，并使GBM细胞对辐射敏感，表现为DDR激活受损、DNA损伤积累、增加MN形成和细胞死亡。⑤相关实验结果表明布比卡因潜在的联合用药可能，可以提高贝伐单抗在GBM治疗中的疗效。

Quantitative proteomic landscapes of primary and recurrent glioblastoma reveal a protumorigeneic role for FBXO2-dependent glioma-microenvironment interactions 

Marcel Buehler 1, Xiao Yi 2 3 4, Weigang Ge…

Neuro Oncol. 2023 Feb 14;25(2):290-302. doi: 10.1093/neuonc/noac169.

最近一些研究揭示了原发性和复发性肿瘤之间总体上相似的克隆结构，以及基因表达的线性和分支进化模式。但是mRNA水平并不能准确地预测功能相关蛋白的丰度。因此，胶质母细胞瘤在疾病进展过程中蛋白质组学的进化在很大程度上是未知的。

在本期研究中，Buehler 等人利用所有理论片段离子谱质谱（SWATH-MS）的顺序窗口来表征配对新诊断和复发的胶质母细胞瘤的两个独立队列的定量蛋白质组，通过免疫组化验证了复发相关蛋白，并在人胶质瘤细胞系、原位异种移植模型和人器官型脑切片培养中进行了进一步的研究；再次通过分析外部空间转录组、单细胞和批量RNA测序数据，以获得机制上的见解。研究结果显示新诊断和复发样本之间的总体定量蛋白质组具有很高的总体相似性，但是复发性肿瘤患者之间蛋白质水平的相关性显著降低，表明复发时疾病的总体异质性较高。免疫组化进一步验证了BCAS1、INF2和FBXO2在复发时是持续上调的蛋白，FBXO2蛋白或转录水平与存活率的负相关，而INF2的表达在蛋白和转录水平上与存活率的关系一致，并且在长期存活（≥3年）胶质母细胞瘤患者中，FBXO2和INF2的丰度均显著降低。此外，不同转录亚型胶质母细胞瘤的蛋白丰度存在显著差异；为了进一步研究BCAS1、FBXO2和INF2在胶质母细胞瘤中的功能作用，作者使用CRISPR/Cas9从人胶质瘤细胞系LN-229和胶质瘤起始细胞系ZH161中生成了单个敲除细胞克隆，结果显示在原位异种移植模型中，FBXO2敲除细胞提高了小鼠存活，并减少了人类器官型脑切片中胶质瘤细胞的生长。这表明，与FBXO2低表达的肿瘤相比，FBXO2高表达的肿瘤浸润更具弥漫性。同时研究分析了与FBXO2表达相关的胶质瘤细胞状态，以及表达FBXO2的癌细胞的空间分布，证实了表达FBXO2的胶质瘤细胞与表现出反应性免疫信号和神经发育转录程序的肿瘤区域相关，更重要的是FBXO2的表达在浸润区强烈富集，在复发时也上调，并且FBXO2在胶质瘤细胞的作用与周围的中枢神经系统组织相交互。

综上所述，本文明确了Fbxo2依赖的胶质瘤-微环境相互作用对促进肿瘤生长的潜在作用，但本研究受到了样本量低和蛋白质覆盖率低的限制，因此还需要更多的努力来了解潜在的分子机制。

ELF4 is a critical component of a miRNA-transcription factor network and is a bridge regulator of glioblastoma receptor signaling and lipid dynamics

Adam Kosti , Jennifer Chiou , Gabriela D A Guardia , Xiufen Lei…

Neuro Oncol. 2023 Mar 14;25(3):459-470. doi: 10.1093/neuonc/noac179.

多形性胶质母细胞瘤(GBM)是成人中最常见的侵袭性脑肿瘤，在神经源性肿瘤抑制因子microRNAs中，miR-124、miR-128和miR-137的缺失与胶质母细胞瘤的未分化状态相关,大部分是对致癌转录因子网络的抑制。

我们在胶质母细胞瘤细胞中进行高通量功能性siRNA筛选，转录因子4 (ELF4)是转录因子网络中最关键的成员之一。ELF4的下调导致GBM细胞明显的增殖延迟和凋亡、胶质瘤干细胞(GSCs)长期生长延迟和形态改变。转录组分析显示，ELF4控制两个相互连接的通路：1)受体酪氨酸激酶信号转导和2)脂质动力学。

受体酪氨酸激酶(Receptor tyrosine kinases, RTKs)是一个高度保守的细胞膜表面受体家族，可以形成二聚体对外界配体作出反应。它们涉及广泛的过程，包括增殖、生存、代谢和分化。GBMs一方面高度依赖于RTK信号，另一方面作为膜结合蛋白，RTK本身依赖于适当的脂质动力学。本研究发现ELF4高度相关GBM调控受体信号转导和脂质稳态两个相互连接过程中的基因，最终影响细胞增殖。

RTK信号转导到多个信号级联，包括动态的丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路，它可以调节细胞增殖、分化和死亡。ELF4的敲除导致MPAK相关基因的下调，如p38、GRB2、SHC2、PTK2B、TNK2和SRC。其中GRB2和SHC2作为适配器，在配体刺激下快速激活PTK；另外PTK2B, TNK2和SRC作为非受体络氨酸激酶，虽然它们缺乏胞外结构域，但帮助RTK二聚，并在细胞膜的细胞质侧传播RTK信号。其他的RTK功能有①EGFR和MET的二聚化依赖于SRC的活性，②TNK2 (Ack1)同时受到EGF和PDGF的刺激，调控EGFR的转运。③PTK2B (FAK2和PYK2)可与SRC协同磷酸化EGFR并激活MAPK活性。

脂质动态直接影响受体功能，脂质种类的改变影响下游RTK信号转导。脂质组学研究发现，ELF4基因的下调降低了磷脂酰胆碱(PC)和磷脂酰乙醇胺(PE)池，提示下调的脂质相关基因负责维持磷脂水平。下调基因中APOE、ABCA7、PITPNM2、PLA2G6和LRP1表现突出。①APOE和LRP1共同将脂质运输到细胞内。②ABCA7、PITPNM2和PLA2G6由于具有调节磷脂动力学的能力而成为ELF4的关键靶点。③ABCA7是一种ATP结合的盒式转运体，将包括PC和PE在内的磷脂翻转到细胞膜的胞外质突起。④PLA2G6是一种不依赖钙的磷脂酶A2，调节磷脂膜的转换，直接水解PC。⑤PITPNM2是一种膜相关的磷脂酰肌醇(PI)转运蛋白，在膜之间转运PI和PC。此外，PITPNM2被ELF4调控的非RTK PT2KB磷酸化，进一步支持了RTK信号和脂质动力学之间的相互依赖性。

尝试使用RTK抑制剂(达沙替尼)和脂质稳态抑制剂(洛伐他汀)处理间充质GSCs和前神经GSCs，以同时靶向这两个相互依赖的通路。结果表明这两种药物具有协同作用，同时靶向这两种途径将干扰GSCs分化。证实ELF4通过直接调节RTK信号和脂质稳态在GBM细胞表型分化中的重要性。尽管转录因子的药物抑制仍然是一个挑战，但上述研究将有助于GBM新治疗的发展。

Homeobox A3 and KDM6A cooperate in transcriptional control of aerobic glycolysis and glioblastoma progression 

Rui Yang , Guanghui Zhang , Zhen Dong…

Neuro Oncol. 2023 Apr 6;25(4):635-647. doi: 10.1093/neuonc/noac231.

糖酵解代谢转录调节因子的改变与脑肿瘤生长有关，但其潜在的分子机制尚不清楚。该研究报道了在胶质母细胞瘤(GBM)患者中异常高表达的转录因子同源盒A3 (HOXA3)，通过转录激活有氧糖酵解，导致细胞增殖和肿瘤生长显著加速的调控机制。

首先，通过肿瘤芯片数据库和肿瘤组织芯片的免疫组化结果表明，HOXA3在胶质瘤尤其是GBM中高表达，且HOXA3低表达的GBM患者较HOXA3高表达的患者生存时间更长。通过体外增殖和细胞周期实验和体内动物实验证明了HOXA3在GBM细胞增殖和肿瘤生长中发挥重要作用。

研究表明，HOX家族蛋白是肿瘤细胞有氧糖酵解的关键调节因子。作者探究了HOXA3在GBM细胞中是否具有类似的功能作用。通过代谢物测量，发现HOXA3缺乏导致葡萄糖消耗和乳酸产生显著受到抑制，但葡萄糖摄取未受到抑制。由于GBM细胞优先使用有氧糖酵解来产生能量，随后作者通过Seahorse细胞能量代谢实验证明了HOXA3沉默的细胞中存在明显的糖酵解抑制，并且HOXA3缺失显著降低了ATP合成酶抑制剂寡霉素诱导的ATP抑制率和细胞增殖。同时，ORC实验证明，HOXA3的敲低增强了GBM细胞的线粒体呼吸。这些结果表明，HOXA3驱动GBM细胞的葡萄糖代谢从氧化磷酸化转向有氧糖酵解。

随后，作者检测了HOXA3沉默或恢复后关键糖酵解相关基因的表达，结果显示HOXA3缺失显著降低了多个糖酵解相关基因中HK2和PKM2的表达。由于HOXA3是一种转录因子，作者检测了HOXA3是否激活HK2和PKM2的转录并确定了HOXA3在HK2和PKM2上的潜在结合位点。通过ChIP和定量PCR实验结合荧光素酶报告基因实验，证明了HOXA3沉默显著抑制了HK2和PKM2启动子的活性。HOXA3作为转录因子的功能取决于它与DNA结合的Hbox结构域。在HOXA3结构域Hbox缺失的GBM细胞中，HK2和PKM2的表达没有变化，且没有促进糖酵解或增加乳酸的产生。这表明，HOXA3是通过激活HK2和PKM2的转录来促进有氧糖酵解的。

接下来探究了HOXA3转录激活有氧糖酵解的潜在机制。通过对TCGA GBM患者数据分析发现HOXA3的高表达导致大量甲基化基因的高表达。ChIP-qPCR显示，HOXA3沉默显著增加了HK2和PKM2启动子处的H3K27me3水平。组蛋白修饰H3K27me3是一种转录抑制因子，受组蛋白甲基转移酶和去甲基化酶调控，包括EZH2、KDM6A和KDM6B。在HOXA3沉默细胞中KDM6A明显减少，进一步的ChIP-qPCR证明了HOXA3激活了KDM6A的转录，并在HK2和PKM2启动子处降低了H3K27me3。随后重组了KDM6A在HOXA3沉默细胞中的表达，并检测了HK2和PKM2的表达，表明HOXA3对于KDM6A修饰HK2和PKM2启动子上的H3K27me3是必不可少的。进一步通过STRING数据集分析、双链-聚乳酸实验以及Co-IP实验表明，HOXA3与KDM6A相互作用，增强糖酵解基因HK2和PKM2的转录和表达。

最后，通过TCGA数据中分子表达和相关性分析发现上述分子之间表达均呈正相关，推测HOXA3可能需要KDM6A来转录调节需氧糖酵解，通过敲低KDM6A对糖酵解能力的检测发现KDM6A沉默可明显降低HOXA3促进GBM细胞有氧糖酵解的能力。动物研究表明，KDM6A敲低显著抑制了HOXA3促进脑肿瘤生长的作用，延长了小鼠的生存期。这些结果均表明，HOXA3需要KDM6A来激活有氧糖酵解和脑肿瘤生长。

总之，该研究证明了一种新的分子机制，即HOXA3介导的转激活和KDM6A偶联的H3K27去甲基化共同调节葡萄糖代谢和GBM进展。

Sialic acid metabolism orchestrates transcellular connectivity and signaling in glioblastoma

Ugne Kuliesiute and others

Neuro-Oncology, Volume 25, Issue 11, November 2023, Pages 1963–1975, doi.org/10.1093/neuonc/noad101

在胶质母细胞瘤（GBM）中，多糖-蛋白质复合物（糖萼）的改变对细胞间连接和信号转导的影响尚待探索。细胞表面糖蛋白的末端糖链的末端的唾液酸，对于细胞间的接触至关重要。然而，目前关于糖萼中的唾液酸代谢在胶质瘤中的作用仍知之甚少。本研究采用人脑切片培养作为研究脑糖生物学（包括糖蛋白的代谢标记和糖萼变化的定量分析）的平台，探索唾液酸代谢在GBM中的作用。

通过活体显微镜、双光子显微镜和超高分辨率显微镜，我们研究了唾液酸代谢改变对GBM形态和功能的影响。通过钙成像技术，我们研究了糖萼改变对GBM网络功能的实际影响。对新合成的唾液酸进行可视化和定量分析，研究人员发现GBM细胞中新合成的唾液酸具有高比率，唾液酸转移酶和唾液酸酶在GBM中高度表达，表明在GBM进展过程中存在大量的唾液酸代谢。抑制唾液酸的合成或去唾液酸化可影响肿瘤的生长模式，并导致GBM细胞网络连接的改变。这项研究结果表明，唾液酸对于GBM肿瘤细胞网络的建立至关重要。这突出了唾液酸在GBM病理学中的重要性，并表明唾液酸动态具有成为治疗靶点的潜力。

Elucidating the neurological mechanism of the FLASH effect in juvenile mice exposed to hypofractionated radiotherapy

Barrett D Allen , Yasaman Alaghband , Eniko A Kramár…

Neuro Oncol. 2023 May 4;25(5):927-939. doi: 10.1093/neuonc/noac248.

近期大量临床前数据现已证明，将平均剂量率增加到超过100 Gy/s可在减少正常组织损伤的同时而不影响肿瘤治疗，因此调节放射剂量率现已被认为是阻击癌症进展的潜在工具。“FLASH放射治疗”(FLASH-RT) 是为了区分在特定射束参数下以超高剂量率进行的放射治疗与临床实践中常见的常规剂量率 (CONV) 的放射治疗。作为临床转化的开端，涉及到放射肿瘤学的各跨学科研究人员现在协同致力于阐明最佳射束参数、分割方案和组织特异性的剂量限制性毒性以及探究放射剂量率调节是如何区分正常组织和肿瘤的。

标准颅脑放射治疗相关的毒性已被充分阐明，其中最紧迫的莫过于长期表现出来的多方面的渐进性认知障碍。对于儿童脑肿瘤患者来说尤其显著，患有最常见类型的原发性脑癌髓母细胞瘤 (MB) 的患者的五年生存率为73.7%；不幸的是，MB的幸存者因密集的颅脊髓照射方案而遭受智商下降、情绪紊乱以及较常人高达 2倍的脑微出血和中风发病率的困扰，所有这些因素都将严重影响生活质量。

认识到这些并发症，该研究小组之前评估了高度放射敏感的青少年大脑对单次大剂量8 Gy FLASH-或CONV-RT的反应。从暴露于FLASH或CONV照射后4个月开始，在各种行为平台上对3周龄幼年小鼠群体进行评估。结果证实，经CONV 照射的小鼠存在显着的学习和记忆缺陷，但经FLASH照射的小鼠则没有出现相似副作用。另有研究证实，FLASH-RT可以避免未成熟的神经元和海马神经发生受到影响，减少神经炎症的同时，保留生长激素的血浆水平。这些令人鼓舞的结果证实了我们过去在成年啮齿动物大脑中的许多发现，并指出了在儿童患者中实施FLASH-RT的可行性。为了进一步证实幼年啮齿动物大脑在2×10 Gy大分割RT方案下的剂量耐受性，并阐明无肿瘤小鼠正常组织保留的神经机制，我们扩展了我们的神经认知测试平台，包括一项名为“objects-in-updated-location (OUL)”的新任务。与此任务相关的增加的认知负荷（严格性）可以使用单个测试来分析多个联想记忆痕迹，并产生啮齿类动物和人类之间可比性较高的数据。该研究小组使用行为学结果与海马突触可塑性和长时程增强（LTP）的电生理学评估相结合的方式，分析了突触密度和结构、神经炎症和脑血管完整性的测量，这些分析结果为FLASH照射的幼年小鼠大脑中正常组织的保护提供了相当大的启发。

RTelomerase inhibition is an effective therapeutic strategy in TERT promoter-mutant glioblastoma models with low tumor volume
Elisa Aquilanti and others
Neuro-Oncology, Volume 25, Issue 7, July 2023, Pages 1275–1285, doi: 10.1093/neuonc/noad024

胶质母细胞瘤是最常见的恶性脑肿瘤5年生存率仅为6%。端粒酶逆转录酶基因(TERT)启动子突变是GBM中最常见的克隆性突变。早期的研究表明，端粒酶的缺失不利于癌细胞增殖。因此，端粒酶是一个值得研究的靶点。但端粒酶的缩短与细胞凋亡之间存在时间差，所以作者假设端粒酶抑制只对肿瘤负荷较低的GBM有效。

研究选用TERT突变型胶质母细胞瘤细胞LN18、T98G、与TERT野生型胶质母细胞瘤细胞SF295、以及CPDM0095和BT112胶质母细胞瘤神经球。使用CRISPR干扰(CRISPRi)进行转录沉默，包括转导pXPR_003携带靶向TERT外显子1(sgTERTe) 的短向导RNA (sgRNA)或TERT的启动子(sgTERTp)，选用靶向次黄嘌呤磷酸核糖转移酶1(HPRT1)启动子或2号染色体的非编码区(sgCh2.4)的sgRNA作为对照。证实利用CRISPR干扰下调TERT启动子突变的GBM细胞系中TERT基因的表达，通过一系列细胞和动物模型试验。最终证明：(1)敲除TERT基因后GBM细胞系的增殖减少，端粒酶的缺失抑制了TERT启动子突变的GBM细胞体外增殖；(2) TERT基因敲除后GBM细胞端粒缩短，形成染色质桥，诱发端粒危机，造成细胞增殖停滞；(3) 在低肿瘤负荷的前提下，体内端粒酶抑制才能延长荷瘤小鼠的生存时间。

TERT启动子突变被认为是在肿瘤发生早期即出现，因此，TERT启动子突变可以提供独特治疗机会，使因肿瘤本身异质性而产生的内在治疗抵抗概率降低。上述研究结果支持了抗端粒酶化合物治疗GBM的临床前景，并有助于确定最大受益的患者群体。

Mitogen-induced defective mitosis transforms neural progenitor cells 

Hiba K Omairi and others

Neuro-Oncology, Volume 25, Issue 10, October 2023, Pages 1763–1774, doi.org/10.1093/neuonc/noad082

促有丝分裂原如血小板衍生生长因子-A（PDGFA）与神经祖细胞（NPCs）表面的受体结合后，触发了一系列信号转导通路。这些信号转导通路通常涉及多个激酶的级联反应，最终调控细胞周期和有丝分裂的进程。复发后拷贝数改变引起的染色体不稳定（CIN）是包括胶质母细胞瘤（GBM）在内的许多实体瘤的特征，然而，在癌症中，调控细胞分裂的基因很少自发突变。本次研究揭示了大脑中PDGFA高表达使得诱导着丝粒和纺锤体装配检查点相关基因无法正常表达，这一缺失引起神经祖细胞中的有丝分裂缺陷。

在正常情况下，细胞周期的各个阶段受到严格调控，以确保细胞的正常分裂和遗传信息的正确传递。然而，在受到促有丝分裂原刺激时，神经祖细胞（NPCs）的细胞周期调控机制可能会受到影响，导致有丝分裂进程出现缺陷。这些有丝分裂缺陷可能包括染色体分离错误、纺锤体组装异常、着丝粒功能失调等。这些缺陷可能导致染色体数目异常或结构变异，从而引发基因组不稳定。基因组不稳定性的累积可能导致遗传变异和表型改变，最终促使神经祖细胞向恶性转化。在这个过程中，细胞可能会获得新的生长优势和生存能力，成为具有恶性表型的肿瘤细胞。

此外，P53蛋白在神经祖细胞的转化过程中也起到了关键作用。P53是一种重要的抑癌基因，它参与了DNA损伤修复、细胞周期调控和细胞凋亡等多个生物学过程。在促有丝分裂原诱导的有丝分裂缺陷过程中，P53的激活可以触发细胞凋亡或衰老，从而限制恶性转化的发生。

使用最近报道的小鼠NPC引发高级别胶质瘤的体外模型，我们研究了PDGFA暴露对NPC（一种假定的GBM起源细胞）的核表型和有丝分裂表型以及基因和蛋白质表达模式的直接影响。研究发现，在含有PDGFA的特定培养基中，神经祖细胞出现了异常分裂，具有P53依赖性。在野生型细胞中，有丝分裂缺陷与P53的激活和细胞死亡相关，但在某些缺失型细胞存活可以容忍有丝分裂缺陷。这些存活细胞具有不稳定的基因组，并在PDGFA的作用下增殖，积累了随机和克隆性的染色体重排。这一过程的结果是产生了一群具有染色体区域反复获得和丢失的致瘤性神经祖细胞，这些区域与GBM中反复获得和丢失的区域是相似的。通过刺激增殖而不为成功的有丝分裂创造条件，PDGFA转化了缺乏P53功能的NPCs。

这些发现揭示了PDGFA在NPCs中诱导有丝分裂缺陷的机制，并强调了这种缺陷在胶质瘤发生中的潜在作用。此外，这些结果还表明，染色体不稳定性可能是GBM等实体瘤的一个关键特征，而PDGFA等生长因子可能通过干扰正常的有丝分裂过程来促进肿瘤的发展。这些见解为开发新的胶质瘤治疗方法提供了潜在的靶点。

Individual glioblastoma cells harbor both proliferative and invasive capabilities during tumor progression

Miriam Ratliff and others

Neuro Oncol. 2023 Dec 8; 25(12): 2150-2162, doi.org/10.1093/neuonc/noad109

由于胶质母细胞瘤的特征是侵袭性和浸润性生长，并且具有明显的异质性，各类假说都在研究肿瘤细胞的增殖和侵袭是否相互关联，或者是否是不同细胞群体的独特特征。

本次研究者首先回顾了胶质母细胞瘤的背景知识，强调了其高度侵袭性和异质性的特点，以及治疗上的挑战性。通过数周时间，利用3D体内双光子激光扫描显微镜实时测定肿瘤细胞的侵袭和增殖。胶质母细胞瘤细胞表达荧光标记物，可以识别其有丝分裂历史或其循环与非循环细胞状态。

这项研究通过建立活体报告系统，使我们能够动态地确定不同肿瘤区域和疾病阶段中不同胶质母细胞瘤细胞的侵袭行为以及先前的或实际的增殖情况。通过观察发现，特别具有侵袭性的肿瘤细胞在数周的追踪过程中逐渐迁移远离主肿瘤团块，表明具有高度增殖和侵袭能力，并且在脑部定植过程中能够保持其增殖能力。

文章还分析了胶质母细胞瘤组织中肿瘤细胞的增殖潜力与侵袭区域的关系。浸润性细胞与多细胞肿瘤细胞网络的连接较少，这是胶质瘤的典型特征。一旦肿瘤细胞在新的脑区定植，其表型逐渐过渡为富含肿瘤微管、相互连接、细胞周期较慢的胶质母细胞瘤细胞。对切除的人胶质母细胞瘤的分析证实，来自侵袭区的肿瘤细胞具有较高的增殖潜力。

结论：在脑肿瘤进展过程中检测到同时具有特别高的增殖和侵袭能力的胶质母细胞瘤细胞，为胶质瘤恶性中增殖和迁移之间的关联性提供了宝贵的见解。这有助于我们了解这种疾病中大脑是如何有效地被定植的。

Mitotic count is prognostic in IDH mutant astrocytoma without homozygous deletion of CDKN2A/B. Results of consensus panel review of EORTC trial 26053 (CATNON) and EORTC trial 22033-26033

Johan M Kros and others

Neuro-Oncology, Volume 25, Issue 8, August 2023, Pages 1443–1449, doi: 10.1093/neuonc/noac282

携带IDH1/2突变且没发生1p19q纯合性缺失的的胶质瘤定义为IDH突变型星形细胞瘤，分级的主要标准是是否发生细胞周期蛋白依赖性激酶4抑制剂A/B（CDKN2A/B）的纯合缺失。分子分类之外，组织学参数是否能提供预后信息仍然需要探索。在这里，我们评估了组织学参数为IDH突变型星形细胞瘤的预后价值。

平次评估组织学特征联合CDKN2A/B纯合缺失（HD）的独立预后能力（小组成员一致性≥4/7）。由7名神经病理学专家组成的国际小组，评估EORTC试验22033-26033（低级神经胶质瘤）192个IDH突变型星形胶质细胞瘤和EORTC 26053实验（CATNON）263个非1p19q共缺失神经胶质瘤的虚拟显微镜图像，主要观察13个明确的组织学特征进行评分，其中192个样本已知CDKN2A/B状态。

评估发现有丝分裂计数（每10个高倍视野标准化为视野直径0.55mm，面积0.24mm²的观察到2个以上有丝分裂）显着影响PFS（P=0.0098），并轻微影响OS（P=0.07）。有丝分裂计数也显着影响CDKN2A/B纯合性缺失患者的PFS，但不影响OS，可能是由于随访数据有限。

有丝分裂指数（ 2 per 10 40× HPF)）对没有CDKN2A/B纯合性缺失的IDH突变型星形细胞瘤具有预后意义。因此，有丝分裂指数可能指导CDKN2A/B非纯合性缺失IDH突变型星形细胞瘤患者的治疗方法。

Integrated molecular analysis reveals hypermethylation and overexpression of HOX genes to be poor prognosticators in isocitrate dehydrogenase mutant glioma

Yasin Mamatjan and others

Neuro-Oncology, Volume 25, Issue 11, November 2023, Pages 2028–2041, doi.org/10.1093/neuonc/noad126

弥漫性胶质瘤占恶性脑肿瘤的80%以上，从低级别到高级别病变不等。在异柠檬酸脱氢酶（IDH）突变的胶质瘤中，生存率存在很大的差异，需要更准确地预测预后。

方法：为了鉴定和表征一个胶质瘤的预后相关分子特征，我们综合分包括甲基化、mRNA、拷贝数变异和突变数据在内的各类分子变异信息，共729个IDH突变样本，来自加拿大大学健康网络（UHN）的99个样本作为测试集，来自德国癌症研究中心（DKFZ）和癌症基因组图谱（TCGA）的2个验证集。

结果：在UHN队列的甲基化数据上进行Cox回归分析，鉴定出了基于CpG的签名，将胶质瘤队列分为两组，对生存有很强的预测能力，并在TCGA和DKFZ的两个独立队列中进行了验证（所有P值< .0001）。甲基化预测的不良结果也显示出高的CNV不稳定性以及HOX基因的高甲基化。使用mRNA和甲基化（iRM）进行的多平台集成分析显示，HOX基因多组学同时过表达和高甲基化与增加的突变负荷、高非整倍性改变和更差的生存率显著相关（P值< .0001）。我们开发并验证了一个包含7个HOX基因算法，用于HOX基因与患者预后最显著相关的1p/19q共缺失或未共缺失的IDH突变型胶质瘤中风险预测。

结论：HOX基因的甲基化和表达在IDH突变的胶质瘤中提供了重要的预后信息，这些信息当前无法通过分子诊断获得。包含7个HOX基因的预后评估显示出在1p/19q共缺失或未共缺失的IDH突变型胶质瘤中生存率的显著差异。

Molecular changes underlying decay of sensory responses and enhanced seizure propensity in peritumoral neurons 

Elena Tantillo and others

Neuro-Oncology, Volume 25, Issue 8, August 2023, Pages 1463–1473, doi: 10.1093/neuonc/noad035

胶质母细胞瘤的生长影响能肿瘤周围神经元网络的结构和功能，改变神经元锥体的活性，进一步推动肿瘤进展。因此识别胶质瘤引发的瘤周神经元的变化非常重要，它可能是一个关键的治疗靶点。

我们将小鼠胶质瘤细胞GL261和CT-2A种植到小鼠枕叶皮层，并在颅内埋藏了电极，然后每周三次连续监测视觉诱发电位的变化，通过记录局部电位比较胶质瘤种植组和对照组小鼠的癫痫易感性。我们发现，在肿瘤进展时，小鼠视觉诱发电位降低，同时局灶性癫痫特征性的delta波增加。

我们还分析了肿瘤周边神经组织的分子特征。采用显微切割分析了第II-III层神经元锥体细胞的分子表达。通过观察胶质瘤小鼠的神经元功能异常，通过视觉诱发电位衰减识别临床出现症状的时间点，在此时间点处死小鼠，激光切割出肿瘤周边的第II-III层神经元椎体细胞，检测与突触传递和神经兴奋性有关的一组基因表达。在这些基因中有两个发生了明显变化：SNARE复合体基因SNAP25和GABA-A受体α1亚单位表达降低。而谷氨酸能通路标志物（AMPA或NMDA受体亚单位）无明显改变。投放苯二氮杂非选择性全反向激动剂DMCM进一步抑制GABA-A信号，在两种荷瘤小鼠中引发了癫痫发作。这些研究显示在临近肿瘤区域细胞发生的新的分子变化。这些变化可作为治疗的靶点以改善患者的生存质量。

荷瘤小鼠的视觉反应性随着肿瘤进展而恶化。A. 左图显示VEP记录过程中的小鼠，右图为实验设计。B, C. 门控（左）和闪光（右）刺激后的视觉诱发电位图形。分别在肿瘤（GBM）和对照（Ctrl）组术后12天（基线），16天（早期恶化）和23天（最后一次测量）记录。在每次测试时均分析VEP波峰至波谷的波幅（N1-P1波幅，虚线箭头）。D, E. 荷瘤小鼠（n=5）和对照组（n=4）平均VEP波幅（平均值±标准误）（双向ANOVA加Holm-Sidak检验，$ P<.05, * P<.001, # P<.0001）。