REF: Kim O, Jung J, Sathe S, et al. Targeting mitochondrial protease in diffuse gliomas. Mol Cancer Ther. Published online July 14, 2026. doi:10.1158/1535-7163.MCT-26-0156

线粒体是至关重要的多功能细胞器，负责细胞能量代谢与生存、大分子生物合成与脂质合成、维持氧化还原平衡以及调节细胞凋亡。由于维持线粒体完整性对确保细胞活力和功能至关重要，靶向线粒体功能已成为癌症治疗中一种有前景的治疗策略。

酪蛋白水解蛋白酶P蛋白水解亚基（ClpP）是一种位于线粒体基质中的ATP依赖性蛋白酶，通过降解错误折叠或受损的蛋白质参与线粒体蛋白质质量控制。ClpP的底物池包括对三羧酸（TCA）循环、氧化磷酸化（OxPhos）、线粒体基因转录和翻译、脂肪酸和氨基酸代谢至关重要的蛋白质。研究表明，过度激活ClpP会导致其底物不受控制的降解，进而导致呼吸链蛋白水平降低、OxPhos受损和细胞死亡。这些发现促使研究者探索将靶向ClpP的化合物作为抗癌的新型治疗方法。ONC201是首个作用于ClpP的亚咪啶酮类（imipridone）药物，能结合并激活人ClpP，目前正在针对多种癌症（包括H3K27M突变型胶质瘤和胶质母细胞瘤）的临床试验中进行评估。基于其已证实的临床活性和机制原理，ONC201已获得FDA批准用于治疗组蛋白H3 K27M突变型弥漫性中线胶质瘤。ONC201的临床开发得到了临床前研究的支持，这些研究表明ClpP激活通过破坏线粒体蛋白稳态和代谢应激通路诱导选择性肿瘤细胞致死。ONC201耗竭ATP，触发线粒体结构和功能损伤，并抑制多条通路，从而破坏乳腺癌细胞的肿瘤干细胞功能。与最初作为多巴胺D2受体（DRD2）拮抗剂和肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）激活剂开发的ONC201不同，TR107是专门设计用于选择性靶向ClpP而无脱靶效应（如DRD2拮抗作用）的药物，在乳腺癌和其他肿瘤模型中显示出对ClpP极佳的效力和亲和力。在低纳摩尔浓度下给予TR107即可破坏线粒体呼吸和代谢，在体外和体内模型中均能抑制肿瘤生长。

IDH突变型胶质瘤是弥漫性胶质瘤的一种独特分子亚型，其特征是IDH1或IDH2的反复突变，这赋予了新形态的酶活性，产生2-羟基戊二酸（2-HG）。2-HG的积累通过抑制α-酮戊二酸依赖性双加氧酶导致广泛的表观遗传重塑，产生超甲基化表型并损害细胞分化。除了表观遗传失调外，IDH突变型胶质瘤细胞还表现出广泛的代谢重编程，包括线粒体功能改变、依赖氧化磷酸化维持生存，以及对线粒体蛋白稳态破坏的敏感性增加。新兴证据表明，这类肿瘤特别依赖线粒体质量控制通路（包括ClpP蛋白酶复合体）来在代谢应激下维持生物能量稳态和生存。这些独特的脆弱性可能为靶向IDH突变型胶质瘤的线粒体通路提供了强有力的理论依据。在本研究中，我们旨在研究TR107对成人弥漫性胶质瘤的作用，并探索支持在IDH突变型肿瘤中使用TR107的潜在代谢脆弱性。

细胞培养、支原体检测和化学品

GSC923细胞系由患者胶质母细胞瘤组织培养获得，由美国国家癌症研究所（NCI）神经肿瘤学分部实验室建立（2016年获得）。GSC20和GSC23（RRID:CVCL_DR59），患者来源的胶质母细胞瘤（GBM）细胞，来自德克萨斯大学MD安德森癌症中心（休斯顿，德克萨斯州，2014年获得）。TS603，一种患者来源的IDH突变型星形细胞瘤（3级）细胞系，来自纪念斯隆凯特琳癌症中心Timothy Chan博士（纽约，纽约州，2018年获得）。BT142（RRID:CVCL_D718），一种患者来源的IDH突变型少突星形细胞瘤（3级）细胞系，购自ATCC（ACS-1018，2021年获得）。BT142 mut/-是一种来源于38岁白人男性左额叶的胶质瘤脑肿瘤干细胞系。BT142 mut/-含有纯合的IDH1 R132H突变，该突变源自杂合IDH1 R132H的BT142细胞。MGG152，一种患者来源的IDH突变型星形细胞瘤（4级）细胞系，来自麻省总医院Daniel Cahill博士（波士顿，马萨诸塞州，2019年获得）。GBM1-IDHwt和GBM1-IDHmut，患者来源的GBM细胞系，由约翰霍普金斯大学医学院Shuli Xia博士提供（巴尔的摩，马里兰州，2021年获得）。胶质瘤干细胞样细胞（GSCs）以三维（3D）球体形式悬浮培养。GSC923、GSC20、GSC23（RRID:CVCL_DR59）、MGG152、GBM1-IDHwt和GBM1-IDHmut培养于NBE培养基中，该培养基由Neurobasal-A培养基、N2和B27添加剂以及重组人碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、表皮生长因子（EGF）、1%青霉素/链霉素（p/s）和1 mmol/L L-谷氨酰胺组成。TS603和BT142细胞培养于添加了N2、20 ng/mL bFGF和EGF、1% p/s和2 μg/mL硫酸肝素的DMEM/F12培养基中。人星形胶质细胞（HA）培养于含10%胎牛血清（FBS）、8 mg/mL D-葡萄糖、1% p/s和50 ng/mL两性霉素B的DMEM/F12培养基中。使用Accutase将神经球解离为单细胞。

所有细胞均在37°C、5% CO₂的加湿培养箱中培养，并定期使用MycoAlert™支原体检测试剂盒检测支原体污染。细胞系鉴定由来源机构在接收前通过短串联重复序列（STR）图谱分析完成；本实验室未进行额外鉴定。所有实验均使用从接收时制备的冷冻库存中复苏后10代以内的细胞。

TR107由Madera Therapeutics LLC提供（专利号WO 2020/176654 A1，实例65，教堂山，北卡罗来纳州）。ONC201（S7963）购自Selleck Chemicals LLC（休斯顿，德克萨斯州）。

细胞活力测定

使用Celigo图像细胞仪进行细胞活力分析时，细胞以每孔5-8 × 10³个细胞的密度接种于96孔板中，进行二维（2D）培养，设三复孔。使用Hoechst 33342（总细胞）和碘化丙啶（PI，死细胞）双染色，按照制造商方案通过Celigo图像细胞仪测定细胞活力。活细胞百分比由处理组活细胞数除以对照组平均活细胞数计算得出。

ClpP基因敲除（KO）细胞的生成

对于ClpP KO，使用sgRNA Scorer 2.0设计向导RNA（gRNA），并将对应于靶位点GCGCCTATGACATCTACTCTGCGG（CLPP KO#1）和GGAGCGCTACTGGTGGCTACTGG（CLPP KO#2）的寡核苷酸克隆至LentiCRISPR-V2质粒中，如前所述。LentiCRISPR v2由Feng Zhang博士赠予。

慢病毒通过使用Lipofectamine 2000将LentiCRISPR-V2质粒与psPAX2和pMD2.G质粒共转染HEK293T细胞产生。分别在转染后48小时和72小时收集上清液，并使用Lenti-X浓缩器溶液和离心法浓缩病毒。将病毒重悬于冷磷酸盐缓冲液（PBS）中，分装后储存于-80°C。使用Lenti-X GoStix按照制造商说明测定慢病毒滴度。用高滴度慢病毒感染细胞，然后用嘌呤霉素进行筛选。通过蛋白质印迹法验证GSC923和TS603细胞中ClpP敲除混合池中ClpP表达的降低。

蛋白质印迹法

使用放射免疫沉淀分析（RIPA）缓冲液裂解细胞，并使用DC（去垢剂兼容）蛋白质测定法测量蛋白浓度。蛋白质印迹分析按先前描述进行。使用以下抗体：IDH1 R132H（Millipore Sigma，克隆HMab-1，#MABC171）、ClpP（Cell Signaling，#14181）、线粒体转录因子A（TFAM）（Cell Signaling，#8076）、TUFM（Thermo Fisher Scientific，PA5-27511）、TSFM（Thermo Fisher Scientific，PA5-27652）、NDUFS3（Thermo Fisher Scientific，#459130）、琥珀酸脱氢酶复合体A亚基（SDHA）（Abcam，#ab14715）、SDHB（GeneTex，GTX113833）、激活转录因子4（ATF4）（Cell Signaling，#11815）、磷酸化AKT（S473）（Cell Signaling，#9271）、磷酸化mTOR（Ser2448）（Cell Signaling，#2971）、磷酸化4E-BP1（Cell Signaling，#2855）、磷酸化S6（Cell Signaling，#4857）、裂解的聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（c-PARP）（Cell Signaling，#5625）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）（Cell Signaling，#5174）和ACTIN（Cell Signaling，#4970）。

蓝色非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（BN-PAGE）和复合物I凝胶内活性测定

细胞在Geltrex包被的10厘米培养皿中进行2D培养，并用二甲基亚砜（DMSO）或25 nM或50 nM TR107处理48小时。细胞用PBS洗涤，并用Accutase收获。将细胞匀浆于添加了1%洋地黄皂苷的样品缓冲液中。在4°C下以20,000 g离心30分钟后，收集上清液。使用DC蛋白测定试剂盒测量蛋白浓度，并将等量样品与样品缓冲液、5% G-250样品添加剂和去离子水混合，在深蓝色阴极缓冲液中于150V下进行天然凝胶电泳。将凝胶在40%甲醇和10%乙酸缓冲液中固定，然后在脱色缓冲液（8%乙酸）中洗涤直至背景洗脱，使用ChemiDoc成像系统进行可视化。

对于复合物I凝胶内活性测定，电泳在浅蓝色阴极缓冲液中进行。将凝胶在新配制的复合物I底物缓冲液（2 mM Tris Cl，0.1 mg/ml NADH，2.5 mg/ml氯化硝基四氮唑蓝）中孵育20分钟。用10%乙酸终止反应，用水洗涤凝胶，使用ChemiDoc成像系统进行可视化。

MitoTracker染色和超分辨共聚焦活细胞成像

细胞在Geltrex包被的带有可拆卸硅胶室的载玻片上进行2D培养，并用DMSO或50 nM TR107处理24小时。细胞用MitoTracker Red CM-H2HRos（500 nM）和Hoechst 33342在37°C CO₂培养箱中染色20分钟。

超分辨共聚焦图像使用配备60× Apo TIRF油浸物镜（N.A. 1.49）和Photometrics BSI sCMOS相机的Nikon SoRa超分辨转盘共聚焦显微镜采集。Z轴序列图像以0.027 μm x-y像素大小和0.15 μm步长采集，采集后使用Nikon Elements软件（v. 5.4.1）中的Denoise.ai算法进行处理。使用Imaris（v. 10.1.1）图像分析软件中基于Labkit机器学习像素分类器的等值面模块对线粒体进行分割，并测量单个线粒体的体积。计算对照组和处理组的平均线粒体体积。在亚细胞线粒体密度过高无法分割为单个线粒体的情况下，通过应用15 μm³的体积大小过滤器排除这些线粒体团块，确保仅体积小于15 μm³的单个线粒体被纳入定量分析。

透射电子显微镜（TEM）测定

细胞在3D培养中，用DMSO或50 nM TR107处理48小时。细胞用PBS洗涤，并在含2%多聚甲醛、2.5%戊二醛的0.1 M PIPES缓冲液（pH 7.4）中于4°C固定1小时，然后过夜。固定后，离心收集细胞，重悬于含50 mM甘氨酸和0.1 M PIPES的淬灭液中15分钟，洗涤后包埋于2.5%低熔点琼脂糖中。将含细胞的琼脂糖块修整为约1 mm³的小块，在室温下用含1%四氧化锇、0.75%铁氰化钾的0.1 M PIPES后固定1小时，用水洗涤三次，然后用1%醋酸铀酰水溶液进行块染1小时。随后洗涤样品，并使用30%、50%、70%、90%和100%乙醇系列脱水，每步10分钟。接着再进行两次100%乙醇和两次100%丙酮更换，然后按照制造商推荐浸渍于Epoxy树脂中。将样品包埋于Epoxy树脂中，在60°C下聚合过夜。将含细胞的树脂块修整，并使用Leica UC6超薄切片机切片。将约70 nm厚的银色超薄切片收集于200目铜网上，用醋酸铀酰和铅染色，在Hitachi 7800透射电子显微镜（80 kV）下观察。使用AMT底部安装相机采集数字图像。

线粒体DNA拷贝数分析

细胞在3D培养中，用DMSO或25 nM TR107处理24小时。使用DNeasy Blood & Tissue试剂盒从细胞中分离基因组DNA。使用人mtDNA监测试剂盒通过实时聚合酶链反应（PCR）分析mtDNA拷贝数变化，该试剂盒使用两个mtDNA靶标（ND1， ND5）。两个核DNA（nDNA）靶标（SLCO2B1， SERPINA1）作为标准。实时PCR反应使用Power SYBR™ Green PCR Master Mix。mtDNA拷贝数计算按照制造商说明进行。

线粒体呼吸和实时ATP产生测定

线粒体呼吸和实时ATP产生分别使用Seahorse XF细胞线粒体压力测试试剂盒和Seahorse XF实时ATP速率测定试剂盒进行评估。简言之，细胞以0.04×10⁶个/孔的密度接种于96孔Seahorse微孔板中进行2D培养。次日，细胞用DMSO或TR107处理24小时。传感器探针板在分析前于非CO₂、37°C培养箱中水化12-18小时。将所有孔中的培养基更换为添加了10 mM葡萄糖、10 mM丙酮酸钠和2 mM谷氨酰胺的XF基础测定培养基。将微孔板加载至Seahorse XF96分析仪后，根据预设程序依次注射线粒体压力测试试剂盒（寡霉素、FCCP、鱼藤酮/抗霉素A）或实时ATP速率测定试剂盒（寡霉素、鱼藤酮/抗霉素A）中的化合物进行测量。数据根据Celigo图像细胞仪测定的细胞数进行标准化。

活性氧（ROS）测量

细胞以6 × 10³个/孔的密度接种于96孔白壁透明底板的2D培养板中，用DMSO或TR107处理48小时。使用ROS-Glo H₂O₂检测试剂盒检测ROS。将H₂O₂底物溶液加入培养基中，孵育6小时。加入ROS-Glo检测溶液并孵育20分钟后，使用POLARStar Optima读板器读取发光信号。数据根据Celigo图像细胞仪测定的细胞数进行标准化。

全局蛋白质组学分析

每个细胞沉淀用500 μL EasyPep裂解缓冲液（含1X磷酸酶抑制剂和通用核酸酶）裂解。通过BCA法测定蛋白浓度。蛋白经还原、烷基化，并用胰蛋白酶/Lys-C消化，用TMTpro标记并纯化。保留约2%的样品用于总蛋白定量，剩余98%依次使用TiO2和IMAC进行富集。多肽使用Dionex U3000 RSLC液相色谱系统联用Orbitrap Eclipse质谱仪进行分析，数据使用Proteome Discoverer 2.4处理。详细方法请参见补充材料。

Ingenuity通路分析（IPA）

将差异表达的mRNA和蛋白结果上传至IPA，并通过核心分析算法计算富集通路列表。基于对数倍数变化（LFC）和p值（0.05）筛选每个细胞系中排名前约500的基因，并根据绝对LFC截断值0.4和p值截断值0.05筛选显著受影响的蛋白，将其与用户设置的背景基因和蛋白集进行通路富集测试。

克隆形成实验

细胞以1000个/孔的密度接种于6孔板，用DMSO或25 nM TR107处理24小时，然后在新鲜无药培养基中培养2周后固定。用4%多聚甲醛（PFA）的PBS溶液固定集落，洗涤后用0.5%结晶紫染色，使用ImageJ软件计数。

细胞周期分析

细胞以0.2 × 10⁶个/孔的密度接种于6孔板进行2D培养，用DMSO或TR107处理8小时、16小时、1天、2天、4天和6天。使用Accutase收获细胞，PBS洗涤，用70%乙醇在-20°C固定。染色前，用冷PBS洗涤细胞，并与500 μL FxCycle PI/RNase染色溶液在室温避光孵育30分钟。数据在BD LSR Fortessa流式细胞仪上采集，并使用FlowJo软件分析。

细胞凋亡测定

使用FITC Annexin V细胞凋亡检测试剂盒（含PI）通过流式细胞术分析细胞凋亡。简言之，细胞以0.2 × 10⁶个/孔的密度接种于6孔板进行2D培养，用DMSO或TR107处理8小时、16小时、1天、2天、4天和6天。使用Accutase收获细胞并用PBS洗涤。然后用细胞染色缓冲液洗涤细胞两次，重悬于100 μL Annexin V结合缓冲液中，加入5 μL FITC Annexin V和10 μL PI溶液。室温避光孵育15分钟后，加入400 μL Annexin V结合缓冲液，样品在BD LSR Fortessa流式细胞仪上分析，使用FlowJo软件。未染色和单染样品用于计算补偿。

实时细胞生长测定

使用IncuCyte S3系统实时测量细胞生长，该系统在6天培养期内量化细胞面积融合度。简言之，细胞以0.06 × 10⁶个/孔的密度接种于12孔板进行2D培养。次日，细胞用DMSO或TR107处理。将测定板在IncuCyte S3系统中，在相差显微镜下，以10×放大倍数自动记录，每24小时成像一次。使用IncuCyte软件分析数据，该软件量化每个时间点的细胞面积融合度值。所有IncuCyte实验每个条件至少设3个复孔。

BrdU细胞增殖测定

细胞以5×10³个/孔的密度接种于96孔板进行2D培养，用DMSO或TR107处理8小时、16小时、24小时、48小时和72小时。使用BrdU细胞增殖检测试剂盒按照制造商说明检测细胞增殖。

统计分析

使用GraphPad Prism软件（版本9.3.1）进行统计分析。数据以均值±标准误（SEM）表示。采用双尾t检验评估实验组间的差异。P<0.05被认为具有统计学意义。P<0.05, P<0.01, P<0.001。

数据和材料的可用性

本研究中生成的全局蛋白质组学数据集已在Gene Expression Omnibus（GEO）的MassIVE存储库（MSV000095625，全局蛋白质组学）公开。

TR107，一种ClpP激活剂，优先靶向IDH突变型患者来源的胶质瘤细胞

为检测TR107的体外抗增殖效力，用递增浓度的TR107或ONC201处理多种患者来源的胶质瘤细胞系（包括携带IDH突变的细胞系），持续4天，然后评估细胞活力。新鉴定的IDH突变型胶质瘤细胞的突变状态通过蛋白质印迹法确认。FDA批准的ClpP激活剂ONC201（Dordaviprone）作为对照。不同细胞系对ONC201的敏感性各异，IC₅₀值范围为0.8至15 μM。相比之下，TR107的效力显著更强，在大多数细胞系中IC₅₀值处于低纳摩尔范围（5.5至99 nM），表明IDH野生型和IDH突变型细胞对TR107的敏感性均高于ONC201。根据药物反应测定的总体IC₅₀趋势，与野生型对应细胞相比，使用ClpP激活剂（TR107或ONC201）治疗在IDH突变型细胞系中更为有效。为确定ClpP激活剂是否对IDH突变型细胞具有优先效应，用TR107以剂量依赖性方式处理IDH野生型和IDH突变型细胞6天，以评估长期效应。有趣的是，剂量递增实验显示IDH突变型细胞TS603在浓度低至12.5 nM时即高度敏感，而IDH野生型细胞GSC923在相同条件下仍保持活力。为进一步证实IDH突变型细胞对TR107更敏感，用通过单碱基基因编辑产生的等基因IDH突变型GBM1细胞，以递增浓度的TR107处理6天。结果一致表明，与野生型对应细胞相比，TR107在12.5 nM浓度下优先抑制IDH突变型细胞的活力。我们还评估了TR107（50 nM，3天）在正常人星形胶质细胞中的细胞毒性效应，发现其细胞毒性极轻微。总之，这些发现表明TR107在纳摩尔浓度下具有高效力，并对IDH突变型胶质瘤细胞具有选择性效果。

图1：ClpP激动剂TR107优先杀伤IDH突变患者来源胶质瘤细胞。(A) IDH野生型胶质瘤细胞经TR107、ONC201处理的剂量-反应曲线 (B)IDH突变胶质瘤细胞经TR107、ONC201处理的剂量-反应曲线 (C) 各胶质瘤细胞TR107与ONC201的 IC50汇总表 (D) TR107处理6 d后IDH野生/突变细胞的长期细胞活力 (E) TR107处理6 d后同基因GBM-1细胞的细胞活力。

TR107的作用依赖于线粒体ClpP，并导致线粒体蛋白降解。

接下来，为验证对细胞活力的影响依赖于ClpP，我们使用CRISPR-Cas9敲除系统检测了TR107的效果。使用两种独立的靶向ClpP的sgRNA，在GSC923和TS603（分别代表IDH野生型和IDH突变型胶质瘤细胞系）中敲除了ClpP。与对照细胞相比，GSC923和TS603细胞中的ClpP敲除混合池均表现出ClpP表达的显著降低。在TR107处理后，在对照细胞中观察到的细胞活力抑制在ClpP缺陷细胞中几乎完全消失。这些结果表明TR107对胶质瘤细胞的细胞毒性效应以ClpP依赖性方式介导。

由于靶向ClpP已被证明会导致线粒体蛋白降解，我们通过全局蛋白质组学分析探索了TR107对蛋白表达的影响，使用100 nM TR107处理GSC923和TS603胶质瘤细胞24小时。将差异蛋白表达结果上传至Ingenuity通路分析，并在图2C中显示了两个细胞系中重叠的富集通路列表。线粒体功能障碍是最显著的通路，在两个细胞系中均具有正z评分，且在IDH突变细胞系TS603中显著性更高。在排名前列的下调通路中，OxPhos和TCA循环II在两个细胞中均被检测到，且在TS603中更为显著。有趣的是，其他代谢通路如生酮作用、甲羟戊酸通路I、香叶基香叶基二磷酸生物合成超通路、异亮氨酸和缬氨酸降解通路在GSC923细胞中失调更为显著。由于全局蛋白质组学分析显示线粒体蛋白受TR107影响，我们进行了蓝色非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和复合物I凝胶内活性测定以检测线粒体呼吸链复合物。TR107（25或50 nM）处理48小时导致所有复合物表达显著降低，尤其在TS603细胞中。与GSC923细胞相比，TS603细胞在两种药物浓度下的复合物I活性也被更显著地抑制，表明TR107通过线粒体复合物I的特定蛋白使IDH突变型细胞的线粒体通路失调。为确定IDH突变是否赋予对线粒体破坏的独特脆弱性，我们首先在时间梯度（包括早期处理时间点6小时和9小时）中检测了TR107处理对IDH突变型和IDH野生型胶质瘤细胞中线粒体蛋白表达的影响。在15 nM浓度下急性处理2天导致两种基因型中多种线粒体蛋白广泛减少，表明TR107对线粒体蛋白稳态产生全局性影响。此外，我们验证了参与线粒体转录和翻译的关键蛋白表达的变化，包括TFAM、TUFM和TSFM。一些线粒体蛋白（如TFAM和TUFM）在早期时间点即对TR107处理有反应，表明TR107可能特异性地影响线粒体蛋白稳态。在GSC923和TS603细胞中，TR107处理后其表达几乎完全消除。此外，复合物I蛋白NDUFS3的表达在IDH突变型TS603细胞中优先下降，而复合物II蛋白SDHA和SDHB在两个细胞系中均显著减少。为确定在IDH突变背景下是否有任何组分被选择性影响，我们接下来使用仅在IDH1状态上存在差异的等基因细胞系对进行了长期暴露测试。值得注意的是，长期处理导致TFAM水平逐渐下降，与其他线粒体蛋白（如SDHA和TUFM）类似。这种协同性降低表明TR107广泛破坏线粒体蛋白稳态，而非选择性地影响单个组分。与此一致，多个线粒体蛋白在两个细胞系中均随时间推移逐渐减少。因此，这些发现支持TR107通过广泛的蛋白稳态破坏损害线粒体功能，这可能有助于胶质瘤细胞对靶向ClpP药物的脆弱性。综上所述，这些结果表明TR107可能通过降解参与OxPhos和TCA循环以及线粒体转录、翻译过程和氨基酸代谢的蛋白质来触发线粒体功能障碍。

图2：TR107的作用依赖线粒体ClpP并引发线粒体蛋白降解。(A) GSC923、TS603细胞ClpP敲除的WB验证(B) 对照组与ClpP敲除胶质瘤细胞的TR107剂量-反应曲线 (C) TR107处理后全局蛋白质组IPA通路富集分析 (D) 线粒体呼吸链复合物蓝天然电泳及复合物I原位活性检测 (E) 患者胶质瘤干细胞TR107处理后线粒体蛋白时间梯度印迹 (F) 同基因GBM-1细胞对TR107应答的线粒体蛋白时间梯度印迹。

TR107在IDH突变型胶质瘤细胞中诱导一系列线粒体功能障碍，表现为线粒体形态改变、mtDNA拷贝数减少、耗氧量受损和ATP产生减少。

使用MitoTracker标记线粒体，并用超分辨共聚焦活细胞成像在经50 nM TR107处理24小时的GSC923和TS603细胞中进行成像。TR107处理在两个细胞系中均诱导了线粒体断裂和结构损伤。相比之下，Hoechst 33342染色的细胞核保持完整，表明处理后核完整性得以维持。为评估TR107是否影响线粒体含量，进行了定量分析以测量DMSO处理对照组和TR107处理组中每个细胞的线粒体体积。TR107在24小时时显著降低了GSC923和TS603细胞中的线粒体体积，表明TR107靶向线粒体并导致其结构损伤。

为进一步观察线粒体形态，进行了透射电子显微镜检测。如图3C所示，DMSO处理的对照细胞显示高密度的正常线粒体，具有完整的嵴（黑色箭头）。相比之下，TR107处理诱导了显著的线粒体改变，与线粒体自噬的多个阶段一致，包括空泡化和嵴崩解。在GSC923细胞中，观察到包裹线粒体的双层膜自噬体（橙色箭头），提示线粒体自噬的早期阶段。此外，在粗面内质网池附近经常观察到嵴破坏的异常空泡化线粒体（红色箭头）。值得注意的是，仅在GSC923细胞中TR107处理48小时后检测到脂滴（黄色箭头）。在TS603细胞中，含有降解线粒体的自噬结构数量增加（橙色箭头），表明线粒体自噬的更晚期阶段。严重降解的线粒体残余，表现为缺乏嵴或空洞的膜结构（红色箭头）也很明显，而形态正常的线粒体基本缺失。尽管有这些线粒体变化，两个细胞系的细胞核形态仍保持完整（蓝色箭头）。与这些观察一致，通过检查TEM图像中细胞形态进行目视判断，TR107处理显著增加了GSC923和TS603细胞的死/活细胞比率，且在TS603细胞中比率明显更高。

线粒体DNA拷贝数被认为是线粒体功能的生物标志物。由于TR107处理抑制了线粒体转录和翻译因子的表达，减少了线粒体体积，并损害了线粒体形态，我们研究了mtDNA拷贝数是否也受到处理的影响。确实，在TR107处理24小时后，GSC923和TS603细胞中的mtDNA拷贝数均显著减少，且在TS603中观察到的下降更为显著。接下来，我们使用Seahorse线粒体压力测定评估了TR107对活细胞中线粒体呼吸和糖酵解的影响。反映线粒体氧化磷酸化的耗氧率在TR107处理24小时后在GSC923和TS603中均被抑制。测量糖酵解的细胞外酸化率显示有轻微增加趋势，在GSC923细胞中似乎比IDH突变型TS603更明显。然后我们测量了实时ATP产生速率，发现TR107显著抑制了两个细胞系中的线粒体ATP水平，同时增加了糖酵解ATP。然而，GSC923中糖酵解ATP的增加似乎补偿了总ATP产生速率，而在TS603细胞中总ATP下降更为显著。这些结果表明，由此产生的生物能量应激、ATP耗竭和线粒体稳态破坏共同降低了细胞通过线粒体能量代谢维持生存通路的能力，从而增强了细胞毒性并促进细胞死亡。换言之，TR107触发的代谢崩溃是该药物抗肿瘤活性的基础。

为检测IDH突变型细胞是否对TR107更敏感，使用了等基因GBM1 IDH野生型和IDH突变型细胞。有趣的是，两种细胞的OCR水平均被抑制，且在IDH突变型细胞中下降更为显著。相反，ECAR测量显示仅在IDH野生型细胞中增加。此外，实时线粒体ATP产生速率在IDH突变型细胞中被抑制，而在IDH野生型细胞中检测到糖酵解ATP的增加。结果，仅在IDH突变型细胞中总ATP产生受到影响。最后，由于TR107导致线粒体结构和功能损伤，我们检测了它是否也影响ROS H₂O₂的产生。确实，TR107处理导致GBM1细胞中ROS H₂O₂水平显著增加。

总的来说，这些结果表明TR107处理在IDH突变型胶质瘤细胞中触发了一系列线粒体损伤，包括线粒体形态改变、mtDNA耗竭、能量代谢紊乱、耗氧率降低和ATP产生减少。

图3：TR107诱发IDH突变胶质瘤细胞线粒体级联功能损伤。(A) MitoTracker染色线粒体超分辨共聚焦成像 (B) 单细胞平均线粒体体积定量分析 (C) 线粒体超微结构透射电镜观察 (D) 电镜视野下死/活细胞比值统计 (E) qPCR检测线粒体DNA拷贝相对数量 (F) Seahorse检测氧消耗率与胞外酸化率能量表型 (G) 线粒体ATP与糖酵解ATP实时生成定量 (H) 同基因GBM-1细胞氧消耗率检测 (I) 同基因GBM-1细胞胞外酸化率检测 (J) 同基因GBM-1细胞总ATP生成水平检测 (K) 同基因GBM-1细胞H₂O₂活性氧水平检测。

TR107诱导的细胞周期阻滞和细胞凋亡激活在IDH突变型细胞中更为显著。

为研究TR107诱导的线粒体应激是否在IDH突变型胶质瘤细胞中触发细胞周期阻滞，在药物处理后8小时至6天的不同时间点检测肿瘤细胞。早在16小时，TS603细胞中即检测到G0/G1期细胞群体增加。与GSC923 IDH野生型细胞相比，从处理第1天开始，TS603 IDH突变型细胞中G0/G1期增加以及相应的S期和G2/M期减少更为显著。在后期时间点（处理的第4天和第6天），尤其是在TS603细胞中检测到亚G1期细胞群体的显著增加，提示在更长时间的TR107处理后，IDH突变型细胞可能发生细胞凋亡。总体而言，TR107似乎通过诱导G0/G1期细胞周期阻滞和抑制S期DNA复制来减少细胞生长，同时在IDH突变型细胞中诱导细胞死亡。此外，为探索TR107对细胞凋亡的影响，在药物处理后8小时至6天的不同时间点对活细胞进行AnnexinV/PI双染色，以匹配细胞周期分析。与GSC923细胞相比，TS603细胞中早期和晚期凋亡细胞比例的增加早在处理第2天即可检测到，且在第4天和第6天细胞死亡更为显著。值得注意的是，在TR107处理第6天，TS603细胞中晚期凋亡细胞的百分比达到96-97%，而在相同药物浓度（25 nM或50 nM）处理的GSC923细胞中仅占47-51%。综上所述，这些结果表明TR107抑制IDH野生型和IDH突变型细胞的活力，然而，IDH突变型细胞在响应TR107处理时经历更显著的细胞周期阻滞和增加的细胞死亡。

图4：TR107诱导的细胞周期阻滞与凋亡在IDH突变细胞中更显著。(A) 流式细胞术分析细胞周期分布 (B) Annexin-V/PI双染流式检测细胞凋亡。

TR107特异性通过抑制mTOR/4EBP1/AKT信号通路在等基因IDH突变型胶质瘤细胞中诱导细胞死亡。

为确定IDH突变型细胞对TR107是否更敏感，使用IncuCyte活细胞成像分析等基因GBM1细胞。用DMSO或15 nM TR107处理GBM1 IDH野生型和GBM1 IDH突变型细胞，并在6天内进行监测。IDH突变型细胞在TR107处理后表现出完全的生长停滞，而IDH野生型细胞尽管生长速率较DMSO处理的对照组有所下降，但仍保持细胞融合度的增加。接下来，我们通过BrdU实验检测了两种细胞的增殖情况，发现在15 nM TR107处理72小时后，与IDH野生型细胞相比，IDH突变型细胞的增殖被显著抑制。最后，Annexin V/PI双染色证实，在响应TR107时，IDH突变型细胞中早期和晚期凋亡细胞比例的增加均大于IDH野生型细胞，表明IDH突变与肿瘤细胞对TR107处理的脆弱性增加相关。

为进一步探索TR107的分子机制，我们对等基因GBM1细胞进行了蛋白质印迹分析。由于已有研究表明ONC201抑制AKT通路并增强mTOR抑制剂在乳腺癌中的持久性，我们检测了TR107对AKT/mTOR通路的影响。有趣的是，p-AKT和mTOR下游靶标p-4EBP1在两种细胞系处理的初始1-2天内均升高，并在持续处理期间维持在相似水平。相比之下，在IDH突变型GBM1细胞中，p-AKT、p-mTOR和p-4EBP1在后期时间点（第4天和第6天）逐渐下降，而野生型细胞中则不然，同时裂解的PARP1保持升高，表明突变细胞中优先诱导了细胞凋亡。有趣的是，p-S6（磷酸化S6核糖体蛋白），AKT/mTOR信号的一个关键下游读数，在IDH突变型GBM1细胞中以时间依赖性方式优先下调。这些发现表明TR107诱导了一种非经典或重连的mTOR信号状态，其特征是差异性的下游底物调控，其中S6K/S6信号被减弱，而mTORC1和4EBP1磷酸化得以维持。TR107处理还以时间依赖性方式增加了裂解的PARP1和ATF4的表达——mTOR激活的一个标志——优先在IDH突变型胶质瘤细胞中。这种升高在长时间孵育期间持续存在，表明TR107诱导的ATF4放大了线粒体应激，最终持续促进IDH突变型胶质瘤细胞的凋亡。与先前关于ONC201的报道一致，我们的发现表明TR107可能类似地影响IDH突变型胶质瘤细胞中的AKT/4EBP1/mTOR活性，将线粒体应激与促生存信号通路的抑制联系起来。

图5：TR107通过抑制mTOR/4EBP1/AKT通路诱导同基因IDH突变胶质瘤细胞凋亡。(A) IncuCyte实时监测细胞汇合度 (B) BrdU实验检测细胞增殖水平 (C) Annexin-V/PI流式检测细胞凋亡比例 (D) mTOR-AKT信号通路时间梯度WB。

ClpP激动作用在体外、离体和体内优先抑制IDH突变型胶质瘤生长

使用ClpP激动剂TR107处理显著损害了IDH突变型胶质瘤细胞的克隆形成能力，与DMSO处理的对照组相比，集落数量和集落大小均显著减少。值得注意的是，在相同条件下，TR107的抗增殖效应在IDH突变型胶质瘤细胞中显著大于IDH野生型对应细胞。此外，对显微切割的IDH突变型胶质瘤微肿瘤进行离体处理，以剂量依赖性方式显示，在暴露于ClpP激动剂后肿瘤细胞活力显著降低，进一步验证了TR107在保留天然肿瘤结构和微环境特征的生理相关离体模型中的疗效。通过颅内植入TS603细胞建立了原位IDH突变型胶质瘤小鼠模型以评估体内治疗效果。为尽量减少药物毒性，我们使用多种方案优化了TR107的给药方案：8 mg/kg每日两次、8 mg/kg每日一次和4 mg/kg每日一次。TR107对ClpP的药理学激活显著延长了荷IDH突变型肿瘤小鼠的总生存期（中位生存期：45天对比50天；对数秩检验，P<0.05）。为评估体内毒性和临床转化，我们在药物治疗后对肿瘤组织进行了药效学分析。具体而言，我们观察到与溶媒对照组相比，TR107处理的肿瘤中凋亡相关标志物水平增加，包括裂解的caspase-3（凋亡标志物）、CHOP（内质网/线粒体应激介质）和ATF4（ClpP的下游靶标）。同时，处理后肿瘤组织中TFAM水平降低，与我们在体外测试中观察到的效果相似。这些发现支持TR107在体内作用于其预期的线粒体通路，并诱导线粒体应激相关的凋亡。值得注意的是，ATF4水平在肿瘤组织中持续显著升高，表明通路持续参与，并表明TR107在所使用的治疗方案下仍保持有效。这种持续的ATF4诱导进一步支持肿瘤细胞通过ClpP激活及其相关的线粒体应激通路受到影响。此外，在TR107治疗方案后仅观察到凋亡标志物（如裂解的caspase-3）的适度诱导，这可能反映了体内凋亡的动态性和瞬时性，其中凋亡细胞从肿瘤组织中被迅速清除。总的来说，这些结果表明ClpP激动作用在IDH突变型胶质瘤的体外、离体和体内模型中均发挥抗肿瘤活性。

图6： ClpP激动在体外、离体、体内优先抑制IDH突变胶质瘤生长。(A) IDH野生/突变胶质瘤细胞集落形成实验 (B) 同基因GBM-1细胞集落形成实验 (C) IDH突变患者肿瘤外植体离体活力检测 (D) 颅内原位荷瘤小鼠TR107给药方案示意图 (E) 荷瘤小鼠Kaplan-Meier生存曲线 (F) 肿瘤组织药效相关WB检测。

本研究证明，TR107（一种新型ClpP激动剂）在IDH1突变型胶质瘤模型中发挥选择性抗肿瘤活性，揭示了由突变型IDH1塑造的代谢和表观遗传格局中独特的潜在治疗脆弱性。我们的发现扩展了靶向IDH1驱动胶质瘤的理解，表明像TR107这样的ClpP激动剂可以利用由线粒体失调诱导的非经典依赖性，而非直接抑制突变型IDH1酶。在机制上，TR107在IDH1突变型胶质瘤细胞中诱导一系列线粒体失调和强烈的细胞凋亡，同时伴有细胞周期阻滞增加。观察到的裂解PARP和ATF4增加表明DNA损伤反应被激活，这可能因IDH1突变型细胞固有的修复缺陷而加剧。先前关于ONC201的研究表明，ONC201上调ATF4-整合应激反应（ISR）-DR5/TRAIL通路可能潜在地影响DNA损伤反应，可能影响像PARP这样的蛋白的活性，这些蛋白在触发癌细胞死亡中发挥关键作用。我们的数据与这些发现一致，并提出了额外的好处，即TR107可能增强线粒体应激介导的凋亡，并通过在此背景下抑制mTOR/AKT通路来阻断肿瘤生长。值得注意的是，TR107在IDH野生型胶质瘤细胞中细胞毒性较小，强调了其潜在的治疗窗口和特异性。这种选择性脆弱性可能反映了由IDH突变固有的代谢缺陷产生的合成致死性。TR107的确切分子靶标仍在研究中，尽管初步的转录组学和代谢组学分析提示其涉及线粒体功能和氧化磷酸化、以及IDH突变型胶质瘤肿瘤细胞生存所涉及的mTOR通路。

激活线粒体蛋白酶ClpP通过降解参与氧化磷酸化和TCA循环的关键蛋白来诱导线粒体功能障碍，导致ATP产生受损和代谢应激。这种线粒体扰动触发了能量感知通路（如AMPK激活），进而负向调控mTOR信号通路。因此，ClpP激活导致mTORC1活性抑制，减少下游合成代谢过程，如蛋白质合成和细胞增殖。ClpP介导的线粒体应激与mTOR抑制之间的这种相互作用强调了线粒体靶向疗法通过代谢重编程和生长抑制发挥抗肿瘤效应的关键机制。

与通过ClpP激活和多巴胺受体（DRD2/DRD3）拮抗双重机制起作用的ONC201不同，TR107的抗癌活性严格依赖于ClpP激活。这种特异性导致多种对能量代谢至关重要的线粒体蛋白显著降解，包括TCA循环和氧化磷酸化机制的组分，导致线粒体呼吸严重受损并诱导向糖酵解的代谢重编程。药代动力学评估进一步显示，与ONC201相比，TR107具有更优越的口服生物利用度和全身暴露量，在相当或更低剂量下具有显著更高的曲线下面积和持续的血浆浓度。重要的是，TR107的细胞毒性效力在细胞环境中的葡萄糖可用性变化时仍保持强劲，而ONC201在低葡萄糖或半乳糖条件下活性降低，表明TR107可能不易受肿瘤微环境中代谢异质性的影响。临床上，ONC201在成功的I-III期试验后已获FDA批准用于H3K27M突变型弥漫性中线胶质瘤，该试验确立了其良好的安全性和有前景的疗效，并扩展到其他适应症如血液系统恶性肿瘤。相比之下，TR107目前处于临床前阶段；然而，在临床前模型中观察到的增强的效力、选择性和药代动力学优势表明TR107有潜力成为下一代线粒体靶向药物，并可能改善治疗结局。需要进一步的研究来评估TR107的转化潜力，包括安全性评估和临床试验评估。

我们的发现揭示了IDH突变型肿瘤中葡萄糖摄取与mTOR通路活性之间的显著联系，而这种联系被线粒体蛋白酶ClpP的药理学激活进一步破坏。已知IDH突变通过积累2-HG来重塑细胞代谢，减少糖酵解通量和葡萄糖摄取。这种代谢重编程抑制mTOR信号，反映了细胞对营养可用性改变和合成代谢需求减少的适应性反应。重要的是，在IDH突变型肿瘤模型中使用ClpP激活剂治疗进一步加剧了线粒体功能障碍，导致葡萄糖摄取显著减少和mTOR信号通路深度抑制。ClpP激活并未恢复代谢稳态，而是破坏了线粒体蛋白稳态，触发线粒体应激并最终诱导肿瘤细胞死亡。这些结果表明，已经代谢受损的IDH突变型细胞对额外的线粒体损伤特别敏感。这种协同脆弱性提示了一种潜在的治疗策略：将代谢应激源（如ClpP激活）与mTOR或葡萄糖代谢抑制剂相结合，可能选择性地靶向IDH突变型肿瘤。总的来说，我们的数据强调ClpP是一个有前景的促凋亡靶点，它通过将线粒体功能与mTOR等营养信号通路解偶联，利用IDH突变型肿瘤的代谢脆弱性。

重要的是，虽然我们的数据提示TR107诱导的线粒体应激与PI3K/AKT/mTOR等生存信号通路之间存在潜在的交互作用，但这些发现应谨慎解读。尽管在我们的实验模型中观察到通路调节，但我们目前的研究并未明确建立PI3K/AKT/mTOR抑制与TR107介导的细胞毒性之间的功能需求或协同交互作用。因此，将TR107与PI3K/AKT/mTOR抑制剂联合的治疗意义在此阶段仍是推测性的。观察到的信号变化可能反映了对线粒体功能障碍的适应性或代偿性反应，而非可增强药物疗效的可操作脆弱性。未来的研究可能需要确定PI3K/AKT/mTOR信号通路的抑制是否能在功能上增强TR107活性并有助于持久的抗肿瘤反应。

尽管ClpP激动剂（如ONC201和TR107）在多个实验平台上表现出一致的抗肿瘤活性，但在原位胶质瘤模型中缺乏显著的总体生存期改善可能是给药方案未优化的结果。具体来说，达到最佳治疗指数可能需要将血浆浓度维持在临界阈值以上持续足够时间，同时避免驱动毒性的过高峰值浓度。ClpP的药理学激活主要诱导线粒体蛋白稳态应激和代谢重编程，这可能导致细胞抑制性生长抑制而非快速的细胞毒性。在侵袭性颅内肿瘤生长的背景下，这种细胞抑制作用可能不足以延迟定义原位胶质瘤模型生存终点的致命性神经症状的出现。此外，IDH突变型胶质瘤细胞表现出代谢可塑性和适应性应激反应通路，可能在体内部分补偿ClpP介导的线粒体破坏，从而限制持久的肿瘤消退。这些适应性反应虽然在短期体外或离体实验中未完全体现，但可能削弱体内长期治疗影响。值得注意的是，ATF4水平在肿瘤组织中持续显著升高，表明通路持续参与，并表明TR107在所采用的治疗方案下仍具有生物活性。这种持续的ATF4诱导支持肿瘤细胞中ClpP相关线粒体应激反应的持续激活。由于机构动物协议要求，肿瘤组织在实验终点（大约最后一次给药后10天）收集。因此，组织收集可能未捕捉到凋亡信号的高峰窗口。鉴于凋亡的瞬时性和体内凋亡细胞的快速清除，观察到的裂解caspase-3的适度水平可能低估了早期治疗诱导的细胞死亡的真实程度。总之，我们的发现表明ClpP激动剂作为组合策略的一部分可能更有效，该策略旨在利用线粒体应激或阻断特定肿瘤类型中的代偿性生存通路，而不是在常规原位胶质瘤环境中作为单一疗法。此外，我们的发现强调了像TR107这样的高选择性ClpP激动剂作为线粒体干扰物的治疗潜力，可能克服与ONC201双靶点机制和代谢敏感性相关的局限性，并为靶向癌症中的线粒体脆弱性开辟新途径。