免疫疗法为众多人类实体瘤的治疗带来了转机，也为胶质瘤的免疫治疗带来了希望。目前也已开展了一系列胶质母细胞瘤（GBM）免疫疗法的研究。然总体来看，只不到20%的胶质瘤患者能从这些免疫疗法中获得持久的临床疗效。但在各种免疫疗法中，肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）也很难浸润至胶质瘤微环境（GME）中。因此，促进TIL浸润至GME中，从而使GME从免疫抵抗状态转变为激活状态的新型免疫疗法可能会有收获。

在抗肿瘤免疫循环中，淋巴细胞的启动和激活对抗肿瘤免疫的形成至关重要，这一过程一般发生在淋巴结等二级淋巴器官（SLO）中。最近有研究表明，这一步骤也可以在三级淋巴结构（TLS）中完成。在结构上，TLS与SLO相似，由T细胞区和滤泡B细胞区组成。成熟的TLS甚至存在生发中心（GC），可作为SLO的代用部位，促进病变微环境中适应性免疫反应的发生。包括在TLS中完成B/T细胞的增殖、体细胞超突变（SHM）以及抗体类别的变换重组（CSR）。

迄今为止，已在多种TME中发现了TLS的诱导形成，而且其分布密度与TME中T淋巴细胞的浸润、预后的改善以及其他免疫治疗后临床效果的提高具有相关性。因此，在“冷肿瘤”（包括GBM）中诱导TLS形成的策略有望用于改善这些肿瘤的治疗效果。在胶质瘤TLS相关研究中，Dimberg A.团队已经成功在GME中诱导了富含高内皮静脉（HEV）和T淋巴细胞的TLS，从而延长了耐αPD-1治疗的胶质瘤小鼠的生存期。

在我们的研究中，对载有脑胶质瘤的小鼠进行颅内注射Toll样受体激动剂和胶质瘤抗原混合制剂（简称为i.c. αTLR-mix），（Toll样受体激动剂使用的是OK-432，一种青霉素灭活并冻干的化脓性链球菌[A组]低病毒株[Su]制剂）。这一联合治疗在GME中成功诱导了TLS的形成，从而控制了胶质瘤的生长并延长了生存时间。我们随后探索了治疗诱导TLS形成的内在机制及其在胶质瘤小鼠中对免疫微环境的改变和在抗肿瘤免疫中的作用。此外，我们还开展了一项相关临床转化研究，对人类GBM样本中TLS的存在和诱导进行了初步探索。

对植入GL261胶质瘤细胞（2×10^5细胞/只）的C57BL/6小鼠进行了i.c. αTLR-mix（治疗）或PBS（对照）原位注射，以观察治疗对胶质瘤生长的影响（图1A）。生存分析表明，治疗组中超过75%胶质瘤的小鼠获得了长期存活（图1B，P<0.005）。基于磁共振成像（MRI）的肿瘤生长分析显示，与对照组相比，治疗组胶质瘤体积更小，肿瘤生长更缓慢（第7天：P=0.775，第14天和第21天：P<0.005）（图1C和1D）。在CT-2A脑胶质瘤模型（5×10^4细胞/只）中，我们同样观察到治疗组的存活时间延长（P<0.05），肿瘤生长速度减慢（第7天：P=0.635，第14天：P<0.05，第21天：P<0.005）（补充图1B-1D，CT-2A中1×10^4细胞/只的结果见补充图1E-1G；略）。然而，我们也注意到，当初始肿瘤负荷增加时（当GL261为2×10^6，CT-2A为5×10^5），治疗在两种模型中都收效甚微（GL261的数据见补充图1H-1J；略）。综上所述，该疗法有效的控制了胶质瘤的生长，并且当肿瘤负荷较低时，延长了的小鼠的生存时间。

在21天时采集治疗组和对照组的脑胶质瘤样本。通过HE、IHC和mIHC染色分析我们发现，在治疗组的GME中分布着这样一些细胞簇，它们是CD45+细胞成簇分布，其主要是CD19+B细胞，此外还包括CD3+CD4+/CD8+T细胞和少量CD11b+髓系细胞（图2A-B和补充图3A）。此外，TLS特异性的结构标志如PD-1+CD4+T滤泡辅助细胞（TFH）、CD19+CD38+记忆B细胞（Bmem）、CD31+MECA-79+高内皮静脉（HEVs）和CD19+Ki-67+增殖B细胞等都可在这一结构中检测到（图2C和补充图3B）。对在第18天采集的血清样本进行检测（图1A），结果显示治疗组中与TLS诱导（LTa、IL17a等）、形成（CXCL13、CCL19等）和维持（BAFF）等相关的细胞因子/趋化因子显著高于对照组（补充图2E；略）。这些发现都显示了在GME中有成熟的TLS形成。这些TLS主要分布于与肿瘤边缘或基质中而非肿瘤中心，尤其是在脑膜、与肿瘤相邻的海马、小脑和脑干裂隙的脑膜中，有些TLS还延伸到同侧甚至对侧的脑室脉络膜（图2A）。以CD11b+髓系细胞为主要组成细胞的TLS的存在表明了TLS可能存在异质性（在这里我们定义“髓系细胞为主要组成细胞的TLS”为CD11b+髓系细胞占TLS细胞总数的50%以上，这些TLS在我们的研究中约占11.54%）（补充图2A；略）。虽然在对照组中也观察到了一些TLS（补充图2B；略），但治疗与两种胶质瘤模型中TLS数量和总表面积的增加呈正相关（图2D和补充图3A）。

此外，细胞定量分析显示，治疗组中B220+总B细胞浸润明显增加（P<0.005），B细胞亚群、CD3+CD4+T和CD3+CD8+T淋巴细胞浸润也均增加，尤其是CD4+T细胞（图2E-F、补充图2C-D和补充图3C-D）。T细胞可以分布在TLS和肿瘤中，而几乎所有的B细胞都位于TLS内或其近周。定量分析显示，在治疗组中，B220+B细胞浸润和CD3+T细胞浸润数量之间存在比例关系（图2G，R=0.886和补充图3E），这也支持TLS的形成促进了效应T细胞和B细胞在GME中的浸润，在抗胶质瘤免疫中发挥关键作用的观点。

为了验证这些观察结果，我们在第21天对正常小鼠脑、对照组和治疗组的脑样本进行了scRNA-seq分析。无监督聚类分析共区分出25个细胞群（图3A、补充图4A和表S1）。在正常大脑中最主要的免疫细胞是小胶质细胞，而对照组中则以巨噬细胞为主。相比之下，治疗组中T细胞和B细胞的比例明显增加（补充图4B和表S2；略）。这些scRNA-seq结果与IHC和FCM数据（图3B）一致，进一步证实了上述结论。

随后，我们又收集了治疗组的同只小鼠的脑肿瘤（Br）样本和肿瘤同侧颈淋巴结（cLN）样本，MACS分离T/B细胞（补图4C；略）。我们对来自Br样本的1525个B细胞和11318个T细胞，以及来自cLN样本的5285个B细胞和4622个T细胞进行scRNA-seq和B细胞受体/T细胞受体测序（BCR/TCR-seq）。分析结果表明，根据转录谱B细胞可分为10个不同的细胞群（图3C中面板和表S3）。其中在cLN样本中，大多数B细胞以幼稚细胞为主，生殖中心B细胞（GCB）和浆母细胞（PB）极少。相反，Br样本中活化和分化的B细胞较多，包括Egr1/Irf4+活化B细胞（cluster5）、Aicda/Mki67/Top2a+GCB细胞（cluster6）、Jchain、Xbp和Mzb+PB（cluster3）以及具有不同型的浆细胞（PC）（cluster13和14）（表S4；略）。T细胞分析显示，不同样本间的T细胞亚群分布各异（图3D和表S4），根据转录谱共区分出了11个细胞群（图3D中间图，补充图4E和表S5）。Cluster12（Il17a-CD4+T）表现出TFH的显著特征（图3E和表S5）。此外，内皮细胞群也表达了HEV和活化内皮细胞的标记（补充图4F；略）。这些scRNA-seq研究结果，尤其是不同B细胞亚群、TFH和HEV的识别，有力地说明了在GME中TLS的诱导形成。

总之，i.c. αTLR-mix治疗能成功在GME中诱导TLS的形成，增强淋巴细胞浸润。这一现象很可能与抗胶质瘤免疫的形成有关。然而，在证实这种相关性之前，我们先重点研究在GME中诱导TLS形成的机制。

首先，根据scRNA-seq数据进行细胞间CellPhone DB分析，在免疫细胞互作中我们发现，T/B细胞与巨噬细胞/小胶质细胞之间有极强的相互作用；而在间质细胞类型中则与内皮细胞之间有极强的相互作用（补充图5A和表S6；略）。在趋化因子配-受体对（L-R）相互作用分析中，对T/B细胞发挥趋化作用的主要是巨噬细胞/小胶质细胞，内皮细胞次之。B细胞的主要趋化因子L-R包括Cxcl13-Cxcr5、Ccl19-Ccr7、Cxcl12-Cxcr4，而T细胞则包括Cxcl16-Cxcr6、Ccl5-Ccr1/5、Cxcl12-Cxcr4、Ccl19-Ccr7等（补充图5B；略）。通过FeaturePlot分析我们也确认了这一点（补充图5C；略）。在TLS诱导过程中，维持B细胞生存和HEV血管生成的关键因子，包括Vegfa、Tnfsf13b(BAFF)和Tnfsf13(APRIL)，主要由巨噬细胞/小胶质细胞表达（补充图5D；略）。这表明某些巨噬细胞/小胶质细胞可能作为“淋巴组织细胞”（LTo）的在TLS诱导中发挥作用。

随后，在分析可能的淋巴组织诱导细胞（LTi）和LTo之间的相互作用时，观察到的高表达的L-R对包括：Tnf-Tnfrsf1a、Lta/b-Ltbr和Tnfsf11-Tnfrsf11a。而且Lta/b-Ltbr在正常大脑中不表达，而在治疗组中为诱导表达（补充图5E；略）。通过FeaturePlot分析，Ltbr和Tnfrsf1a主要在巨噬细胞/小胶质细胞上表达，这也与其功能性"LTo"状态一致，而Tnf主要由巨噬细胞/小胶质细胞表达，Lta/Ltb在T/B细胞上表达（图4A）。这一观察结果促使我们初步确定了功能性“LTi”细胞的身份，并通过抗体中和实验加以证实。

为了评估这一结果，将αTLR-mix与TNF-α阻断抗体（αTNF）、LTβR阻断抗体（LTβR-Ig）或IgG同型对照抗体（MOPC-21）一起分别经立体定位仪注射到胶质瘤小鼠的大脑中。结果表明，与对照组MOPC-21相比，αTLR-mix联合应用αTNF或LTβR-Ig都不能抑制胶质瘤的生长（图4B、补充图5F和补充图6A-B）。对脑样本的分析显示，αTNF组仍有典型的TLS形成（图4C-D、补充图5G-H和补充图6C-F），但定量分析显示TLS的数量和总表面积均减少（图4C和补充图6F）。但是，在LTβR-Ig组中，只有一些松散聚集的免疫细胞，没有典型的TLS形成（图4D和补充图6E），与对照组相比，B/T细胞总数（补充图5H和6D）明显减少。这表明阻断LTβR对TLS的形成有极大的影响。至此，我们推测表达Lta/Ltb的T细胞可能具有"LTi"细胞的功能。随后的分析表明，在我们的研究中，CD4+Th17细胞（标记基因特征Cd4、Il17a、Maf）表现出显著的"LTi"转录特征，如Rorc和Ltb（表S5；略），支持Th17细胞作为功能性"LTi"细胞的观点（图4E）。

总之，在我们的研究中，Th17细胞可能发挥功能性“LTi”作用，而某些巨噬细胞/小胶质细胞可能发挥功能性“LTo”作用。它们通过LTα/LTβ-LTβR相互作用，刺激相关趋化因子和其他因子的分泌，从而启动TLS的诱导。当然，这些结果还需要通过更多的细胞和动物实验来进一步验证。

在上述实验中，我们注意到在抑制TLS诱导形成过程中（LTβR-Ig组）还会导致TILs数量的减少。这一结果说明，TLS诱导对免疫细胞的浸润起着至关重要的作用，也表明了它在抗胶质瘤免疫中的重要意义。随后，我们通过在治疗组局部（颅内）和全身（静脉注射）给予相应的阻断抗体，分析TLS中CD4+T、CD8+T和CD19+B细胞等主要免疫细胞成分在抗胶质瘤免疫中的作用情况。

在αCD4组中，我们观察到没有TLS诱导形成，CD4+T和CD19+B细胞浸润明显减少（图5A、补充图7B-D和补充图8C-F），与PBS对照组比，胶质瘤生长加速（图5B、补充图7A和补充图8A-B）。αCD4治疗与TLS数量和总表面积的明显减少有关（图5A和补充图8D）。这些结果说明了CD4+T细胞在TLS诱导和抗胶质瘤免疫中不可或缺的作用。此外，CD8+T细胞也在抗胶质瘤免疫中发挥了重要作用，而CD19+B细胞则没有。尽管如此，αCD8组和αCD19组的TLS形成和T细胞浸润仍很明显，只是TLS的数量和总表面积有所减少。

总之，在我们的研究中，CD4+T细胞和CD8+T细胞共同发挥了抗胶质瘤免疫反应。然而，在TLS诱导中，CD4+T细胞发挥了更关键的作用，这与上述结果一致。尽管B细胞在抗胶质瘤免疫中没有发挥重要作用，但它们几乎全部位于TLS内或周围，而在正常脑样本中几乎没有分布，这表明它们有可能成为研究GME中TLS功能的可行靶标。

我们接着分析了B/T细胞的scRNA+BCR/TCR-Seq数据（补充图4C；略）。如前所述，Br样本中的B细胞亚型与cLN样本中的B细胞亚型明显不同。T细胞的状态与B细胞的状态相似，在cLN样本中，大多数T细胞为Ccr7+幼稚型CD4+T细胞，而在Br样本中，大多数细胞为活化和分化的T细胞（补充图9A-B；略）。Br样本中B/T细胞的单细胞图谱几乎涵盖了全面的活化状态，确定了由未经抗原激活的幼稚细胞和经抗原激活的成熟细胞组成的B/T细胞群。

以幼稚B细胞为预设起点，Br样本中B细胞的轨迹分析显示了一条从活化B细胞到GCB细胞再到PB或PC的分化轨迹（图5C）。沿着Monocle拟时序分析对基因表达变化的研究也揭示了B细胞分化不同阶段转录程序的显著变化（图5D、补充图7E和表S7）。该轨迹将细胞成熟顺序排列为幼稚期、活化期、GC期和PB期，说明了从早期活化事件到GCB细胞形成的整个基因表达变化过程。包括关键信号分子和转录因子的动态表达。脑样本B细胞的重构还表现在GCB细胞中与CSR相关基因的富集（补充图7F；略）。同时，我们分析了V gene usage的情况，以分析脑样本与相关cLN对照组之间是否存在V gene usage和细胞分化克隆型的偏倚。在GCB细胞和PB中存在明显的克隆选择，VH gene usage表现出更大的极化（图5E和表S8）。这种BCR在Br中的使用模式与在cLN中观察到的不同。对不同样本中总B细胞的抗体异型频率（补图7G；略）和不同B细胞亚型的体细胞突变（SHM）水平多样性（补图7H和表S9；略）进行了量化。结果表明，cLN中的B细胞大多是未转换的，包括IghD和IghM，而Br中的B细胞大多是转换的，包括IghG和IghA。应用Monocle 2算法对CD4+T细胞进行拟时序分析，显示了它们的发育轨迹。同时，TRA V gene usage分析表明，Br中的T细胞大多处于活化和分化状态（补充图9C-E；略）。基于这些分析，尤其是B细胞的相关分析，我们推断GME中诱导的TLS也有可能成为适应性抗肿瘤免疫反应的特区部位。

在完成了小鼠胶质瘤模型中TLS形成的相关研究后，我们又致力于评估其在临床胶质瘤微环境中的存在和功能。最初，我们利用TCGA公共数据来区分GBM样本中TLS存在的异质性。对12个TLS相关趋化因子基因的基因表达谱进行聚类，发现了两个类群（A和B）（图6A和表S10）。然而，在TLShigh（聚类A）特征聚类中没有发现预后差异（P=0.585）（图6B）。然而，当使用ssGSEA评估免疫细胞的功能和富集水平时，TLShigh群组中28种免疫细胞的浸润水平更高。这包括抗肿瘤免疫细胞（如NK细胞、CD4T细胞、CD8T细胞）和促肿瘤免疫细胞（如M2巨噬细胞、T-helper2细胞、髓源抑制细胞（MDSCs）和Treg细胞）（补充图10A；略）。这些结果表明，TLShigh亚型代表了一种以高免疫浸润为特征的GBM形态。

除公共数据外，我们还进行了相应的临床试验（NCT05131711）。这项研究观察了立体定向放射治疗和αTLR（OK-432）联合治疗复发性GBM（rGBM）的临床效果。与小鼠模型类似，αTLR通过Ommaya囊进行瘤内注射，立体定向放射治疗诱导肿瘤细胞死亡（附图10B；略）。目前，实验组已纳入13名患者，对照组纳入11名患者，他们的基本特征见表S11。目前，所有患者对治疗的耐受性良好，无严重不良反应；其中，50%的患者胶质瘤体积缩小（2例完全应答（CR），5例部分应答（PR）），75%的患者对联合治疗有应答（包括2例疾病稳定（SD））。此外，与对照组相比，联合治疗明显延长了无进展生存期（PFS）（P<0.01）和总生存期（OS）（P<0.05）（图6C和补充图10C）。这间接证实了联合治疗可诱导有效的原位抗肿瘤免疫。遗憾的是，治疗后的肿瘤样本获取困难，所以直接观察TLS是否形成以及局部抗胶质瘤免疫是否形成对目前临床实验来说较为困难。我们在治疗前后从Ommaya囊中收集了CSF并进行TLS相关趋化因子/细胞因子检测，我们发现治疗后TLS相关趋化因子/细胞因子与治疗前相比明显增加（图6D）。