近期，山东大学齐鲁医院神经外科李刚、薛皓研究团队在神经医学期刊《Annals of Clinical and Translational Neurology》发表了题为《Intraoperative rapid molecular diagnosis aids glioma subtyping and guides precise surgical resection》的研究论文。本研究利用课题组前期自主研发的自动集成基因检测系统（automatic integrated gene detection system, AIGS），床旁检测脑胶质瘤患者的异柠檬酸脱氢酶（Isocitrate dehydrogenase, IDH）和端粒酶逆转录酶启动子（Telomerase reverse transcriptase, TERTp）突变状态，实现了术中胶质瘤亚型精准诊断并指导手术切除，显著提高了患者的肿瘤全切除率，进而改善患者预后。
Li J, Han Z, Ma C, Chi H, Jia D, Zhang K, Feng Z, Han B, Qi M, Li G, Li X, Xue H. Intraoperative rapid molecular diagnosis aids glioma subtyping and guides precise surgical resection. Ann Clin Transl Neurol. 2024 Jun 24. doi: 10.1002/acn3.52138. Epub ahead of print. PMID: 38924338.
胶质瘤是最常见的原发性恶性脑肿瘤，不同胶质瘤亚型的术后生存率存在显著差异。尽管近几十年来神经外科发展迅速，但胶质瘤的治疗进展缓慢，仍以影像学引导下的最大范围安全切除为主，患者获益有限。在当前肿瘤分子诊疗的时代大背景下，基于分子病理指导下的胶质瘤亚型诊断和外科手术切除成为攻克胶质瘤的新的研究热点。但是目前多依赖于免疫组化（Immunohistochemistry, IHC）、NGS及Sanger测序技术检测患者基因突变信息，较长检测时间限制了其在手术中的应用。如何在术中快速、准确获取患者基因突变信息是当前亟待解决的问题。相关研究表明，在IDH突变型胶质瘤中TERTp突变几乎与1p/19q联合缺失伴随存在；而在IDH野生型胶质母细胞瘤中TERTp突变发生率为70%-80%，且预后不佳。因此，我们提出利用IDH及TERTp基因作为辅助胶质瘤分型诊断及精准切除的分子标志物。我们的前期研究已经证实，基于PCR改良的AIGS床旁检测IDH突变联合术中快速病理有助于精准诊断胶质瘤，同时可以用于术中识别IDH突变型胶质瘤的分子边界。在本研究中，我们进一步利用已有的AIGS技术快速检测IDH/TERTp突变实现了胶质瘤的术中亚型诊断，并根据分子病理制定了个性化手术方案，进而评估其作为一种术中分子诊断工具辅助胶质瘤亚型诊断和指导手术策略的实际应用价值。
纳入标准及检测流程
Figure 1. The flow chart of AIGS intraoperative assistance for the precise diagnosis and treatment of gliomas. (A) Intraoperative rapid detection of IDH/TERTp mutations using AIGS enables intraoperative integrated diagnosis of gliomas. (B) Personalized surgical regimens based on integrated intraoperative diagnosis. (C) Results of various mutation types for AIGS detection of IDH mutations. IDH mutation negative, only a Cy5 fluorescence curve shows typical S-shaped amplification (including S-curve that do not reach a plateau); IDH1 R132H mutation, ROX and Cy5 curves both show typical S-shaped amplification (including S-curves that do not reach a plateau); IDH1 R132L mutation, FAM, ROX, and Cy5 curves all show S-shaped amplification (including S-curves that do not reach a plateau); IDH other type, FAM and Cy5 curves both show typical S-shaped amplification (including S-curves that do not reach a plateau). (D) Results of AIGS detection of various types of TERTp mutations. TERTp mutation negative, only a Cy5 fluorescence curve shows typical S-shaped amplification (including S-curve that do not reach a plateau); TERTp C228T mutation, FAM and Cy5 curves both show typical S-shaped amplification (including S-curves that do not reach a plateau); TERTp C250Tmutation, ROX and Cy5 curves both show S-shaped amplification (including S-curves that do not reach a plateau).
研究结果
Figure 2. The value of AIGS in the clinical application of intraoperative assistance for accurate subtype diagnosis of glioma. (A) The extent of STR, GTR, SupTR, and precision resection of glioblastoma. (B) Mean intraoperative rapid histopathology reporting time and AIGS detection time. (C) The NGS was used as the gold standard to test the accuracy of the AIGS results. (D) Postoperative integrated diagnosis of the patients (WHO CNS5, n = 41). (E) Proportion of astrocytomas, oligodendrogliomas, and glioblastomas in the preliminary diagnosis and intraoperative integrated diagnosis, and the accuracy of glioma subtype diagnosis in both diagnostic methods. (F) The EOR in AISG-detected and non-AIGS-detected groups.
Figure 3. Intraoperative use of TERTp mutations to determine tumor molecular margins in a patient with GBM. (A) The flow chart for precision resection in patients with GBM. (B) Results of intraoperative IDH and TERTp mutation detection. (C) Multi-point sampling of the tumor cavity (D: depth, F: front, T: top, B: back). (D) Results for each part of the test. (E) Preoperative and postoperative MRI comparison (Red: areas of T1w enhancement; Blue: areas of T2w/Flair abnormalities; Green: areas of surgical resection). (F) Postoperative Sanger sequencing results.
Figure 4. Postoperative survival of patients. (A and B) Overall survival and progression-free survival of IDH-wt patients in AISG-detected and nonAIGS-detected groups. (C and D) Overall survival and progression-free survival of TERTp-mt and TERTp-wt GBM patients in the AISG-detected group after surgery. (E and F) Overall survival and progression-free survival of patients with IDH-wt/TERTp-mt compared to IDH-wt/TERTp-wt in relevant studies in the last decade.
讨 论
手术切除范围（Extent of resection, EOR）是影响胶质瘤患者预后的最重要因素之一。虽然胶质瘤的诊断和治疗已进入分子时代，但相关检测技术的发展仍不能满足我们的术中需求。目前，我们只能依靠术中快速组织病理学进行初步组织学分类，甚至有些患者需要花费大量时间进行术中反复取样和送检，严重限制了主刀医生的术中决策。我们前期研究表明，检测IDH突变结合快速组织病理学检查可有效提高胶质瘤术中诊断的准确性，从而使神经外科医生能够更加积极主动地开展手术。然而，这还远远不够。因为不同亚型、不同部位的胶质瘤在手术切除难度、术后辅助治疗方案以及预后方面都存在显著差异。因此，术中明确的胶质瘤亚型诊断将有助于治疗决策的制定，无论是术中制定手术切除方案，还是术后确定近期是否需要辅助治疗。我们的前辈早在十年前就发现，TERTp-mt在IDH-mt胶质瘤中总是伴有1p/19q缺失，但由于外科基因检测技术的限制而未能深入研究。我们通过开发针对所有类型胶质瘤的个性化手术方案，提高了胶质瘤患者的总切除率。
胶质瘤手术切除的原则是最大范围安全切除。我们通常将EOR达到影像学边缘（MRI显示的边缘）视为胶质瘤的完全切除，但很难判断这是否真正实现了肿瘤细胞的完全切除。相关研究发现，胶质母细胞瘤术后容易复发，且多数发生在瘤周2厘米范围内。Li等发现，对于胶质母细胞瘤患者，切除≥53.21%的T2w/Flair异常区域可显著延长患者生存期。因此，我们对胶质母细胞瘤，尤其是TERTp-mt GBM进行了SupTR治疗。考虑到星形细胞瘤和少突胶质细胞瘤患者未达到中位生存期，单独分析了分子病理指导下的GBM扩大切除的患者预后明显改善。然而，我们发现即使EOR已超过T2w/Flair异常面积的50%，许多GBM患者仍会在术后短时间内出现肿瘤复发。这是因为胶质母细胞瘤细胞具有浸润性生长模式，导致肿瘤侵袭范围广泛，肿瘤细胞往往扩散到T1-CE区域以外的瘤周脑水肿（PTBE）区域，甚至更远的脑组织。iMRI、iUS和神经导航等技术的应用大大提高了胶质瘤的全切除率，但患者的总体预后较差。神经导航技术建立在术前成像的基础上，而术前成像在一定程度上受到手术中体位变化和脑脊液释放时不可避免的脑漂移的影响。使用iMRI和iUS可以通过实时定位纠正脑漂移，但iUS因分辨率低而无法准确识别肿瘤边界，而iMRI价格昂贵且难以普及。随着胶质瘤分子病理学的引入，我们希望有一个客观的指标来明确胶质瘤的EOR。因此，对于TERTp-mt GBM患者，我们建议使用TERTp突变作为肿瘤标记物来确定肿瘤分子边缘。在本研究中，我们通过对2例TERTp-mt GBM的手术切除边界进行多点取样来确定肿瘤分子边缘，结果惊讶地发现，分子边缘不仅位于水肿区内，在某些方向甚至超出了水肿区。这可能是胶质母细胞瘤患者术后短时间内复发的原因之一。使用AIGS检测确定胶质瘤分子边缘也许是实现胶质瘤全切除的最佳选择。
随着CNS5的发表，越来越多的研究人员致力于探索有效的基因检测工具，以指导胶质瘤的精确诊断和治疗。目前，主流的研究方向包括：i，利用质谱检测肿瘤代谢物2-hydroxyglutaric acid来确定IDH突变，该方法检测时间短，但准确性较差；ii，基于PCR的改良基因检测技术可直接检测IDH/TERTp突变或其他突变，但多处于实验室研究阶段。在本研究中，所有AIGS检测均在手术室完成，耗时更短，灵敏度和特异性更高。与其他检测技术相比，我们的技术具有仪器微型化和多通道同时检测的优势。而且，我们已经完成了临床转化。虽然AIGS检测时间约为1小时，但与对照组相比，AIGS检测组的手术时间并无明显延长，术后并发症的发生率也无明显变化，表明该技术具有较高的临床实用性和安全性。此外，术中快速诊断患者的胶质瘤亚型可以缩短术后放疗和化疗的等待时间，并有可能在术中对胶质瘤进行原位靶向治疗。
结 论
1.基于PCR技术改良的AIGS可以在术中快速、准确检测IDH/TERTp突变状态。
2.术中快速分子诊断联合快速组织病理可实现星形细胞瘤，少突胶质细胞瘤和胶质母细胞瘤的术中整合诊断。
通讯作者简介
李刚 教授
山东大学齐鲁医院
主任医师，山东大学二级教授，博士生导师
山东大学脑与类脑科学研究院副院长，神经外科学科带头人
泰山学者攀登计划专家，新一批享受政府特殊津贴专家
主要兼职：
山东省医学会脑胶质瘤多学科联合委员会主任委员
中国医师协会脑胶质瘤专业委员会副主任委员
山东省医学会第十五届理事会理事
山东省医学会神经外科分会前任主委
《中华神经外科杂志》、《中华神经外科杂志（英文）》、《Neurosurgery》中文版编委
近五年主要科技奖励：
2019年11月获得山东省科技进步一等奖（第一位）
2022年12月获得山东省科技进步一等奖（第一位）
其他学术成就：
先后承担国家自然科学基金面上项目7项，国家自然科学基金重大培育项目1项，国家"十二五"重大科技支撑计划子课题2项，山东省重大科技创新工程1项，山东省自然科学基金，省科技发展计划等省部级课题10余项；授权国家发明专利18项（转化4项）、实用新型专利4项，软件著作权3项；以第一或通讯作者在Molecular Cancer、Advanced Science、Neuro-oncology、Autophagy、Theranostics、Clinical Cancer Research等国际著名学术期刊发表论文160余篇，其中SCI收录130余篇；已培养博士后5人，在站博士后6人，博士研究生52人，硕士研究生97人
薛皓 教授
山东大学齐鲁医院
医学博士，教授，副主任医师，博士研究生导师
山东大学齐鲁医院神经外科主任助理
国家级“万人计划”青年拔尖人才，泰山学者青年专家
主要兼职：
中国医师协会胶质瘤专业委员会药物与生物治疗学组秘书
山东省医学会脑胶质瘤多学科联合委员会委员兼秘书
山东省医学会神经外科分会委员兼学术发展学组秘书
山东省生物医学工程学会医疗器械专委会常务委员等
近五年主要科技奖励：
2019年11月获得山东省科技进步一等奖
2022年12月获得山东省科技进步一等奖
其他学术成就：
主持国家自然基金项目3项，科技部重大专项子课题1项，省部级项目5项；授权国家发明专利17项（转化4项），实用新型专利2项，软件著作权3项；发表SCI论文80余篇，第一及通讯作者发表中科院一区论文20余篇（ESI高被引论文3篇）
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