2024年04月02日发布 | 1327阅读

【中国声音】深圳大学第一附属医院黄国栋/赵华福团队揭示LanCL2蛋白Tyr295磷酸化及其入核调控胶质瘤浸润生长与进展的新机制

赵华福

深圳大学第一附属医院（深圳市第二人民医院）

黄国栋

深圳市第二人民医院（深圳大学第一附属医院）

近日，深圳大学第一附属医院（深圳市第二人民医院）神经外科（国家临床重点专科）黄国栋/赵华福团队在《Journal of Advanced Research》（IF:10.7，中科院一区）上发表了题为“Nuclear transport of phosphorylated LanCL2 promotes invadopodia formation and tumor progression of glioblastoma by activating STAT3/Cortactin signaling”的研究论文。该研究发现c-Met可驱动LanCL2蛋白Tyr295残基磷酸化及转运入核，后者通过激活STAT3/Cortactin信号通路，促进胶质母细胞瘤侵袭性伪足形成和动物体内移植瘤的浸润生长和进展。该研究首次提出了LanCL2蛋白通过Tyr295磷酸化的激活机制，分析了c-Met/LanCL2/STAT3/Cortactin信号通路在胶质母细胞瘤侵袭和进展中的重要调控作用，为胶质母细胞瘤的治疗提供新的靶点。深圳大学第一附属医院（深圳市第二人民医院）神经外科黄国栋教授和赵华福副研究员为本文的共同通讯作者，赵华福和刘运生副研究员为本文的共同第一作者。



背景


胶质母细胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM）为最常见，恶性程度和侵袭性最高的原发脑肿瘤。GBM的高度侵袭特性致使肿瘤和正常组织界限不清，手术无法完全切除[1]。而且，GBM细胞浸润正常组织后能形成特殊的肿瘤微环境，从而促进肿瘤的耐药及免疫逃避[2,3]。但是，GBM高度侵袭的生物学特性也为分子靶向治疗提供了潜在的治疗靶点和崭新的治疗策略。因此，寻找更为有效的分子靶点抑制GBM细胞侵袭，开发新的抗侵袭药物，对于提高GBM的干预治疗效果，改善GBM患者的预后具有重要意义。羊毛硫氨酸合成酶C样蛋白2（lanthionine synthetase C-like protein 2，LanCL2），是一种表达在人免疫细胞、上皮细胞和肌肉细胞中的脱落酸（abscisic acid，ABA）受体，参与应激反应、组织生长、炎症调节、糖代谢等信号传递[4,5]。目前LanCL2蛋白在肿瘤中的相关研究较少，黄国栋/赵华福团队前期发现LANCL2是一个影响年轻GBM患者诊断和预后的关键基因，并且与GBM复发密切相关[6]。然而，LanCL2蛋白在胶质母细胞瘤中的生物学作用及其参与的信号通路尚不清楚。因此，该研究旨在研究LanCL2在GBM中的生物学功能，阐明LanCL2参与的信号通路及其活化机制。



研究结果


1.下调LanCL2表达可显著抑制GBM细胞的迁移/侵袭，及侵袭性伪足的形成


作者采用靶向LANCL2基因的siRNA和shRNA慢病毒表达系统作用于GBM细胞，发现敲低LanCL2表达显著抑制了GBM细胞迁移和侵袭能力，并降低了Cortactin、MARCKS、ROCK2和Myosin IIa的磷酸化和蛋白表达水平（图1）。而且敲低LanCL2表达还明显抑制了侵袭性伪足和黏着斑的形成（图2）。


图1. 下调LanCL2表达可降低GBM细胞的迁移/侵袭能力。


图2. 下调LanCL2表达可抑制GBM细胞侵袭性伪足和黏着斑的形成。


2.LanCL2转运入核是其发挥功能的关键


作者前期研究发现LanCL2的胞内定位与胶质瘤的恶性程度相关，其主要表达在GBM的细胞核中，而在低级别胶质瘤（I-II级）中则主要表达在细胞质[6]。为了研究LanCL2的入核机制及在核内的功能，作者利用脱落酸（ABA）作用于GBM细胞，发现ABA能激活LanCL2，驱动其转运入核，并提高下游Akt的磷酸化水平，从而促进GBM细胞的侵袭。用NLS Mapper软件预测LanCL2的核定位信号为N端序列GETMSKRLKLH（图3）。作者随后采用免疫共沉淀-质谱法（CoIP-MS）鉴定出与LanCL2结合的蛋白，包括有细胞骨架相关蛋白如Cortactin、Gamma-actin 和LIMA1，介导转录和RNA剪接的核蛋白如SLTM、CHTOP和SRSF家族蛋白，以及参与核糖部分翻译过程的蛋白如EIF6、NHP2、RSL1D1。GO富集和KEGG通路分析表明，LanCL2结合蛋白参与了多种生物学过程包括RNA加工、mRNA剪接、核转运、基因表达和核糖体生物合成等。这些结果表明LanCL2激活后转运入核，并调控RNA加工和基因表达等过程。


图3. ABA可激活LanCL2，促进其转运入核。


图4. LanCL2的结合蛋白参与了RNA加工、mRNA剪接、核转运、基因表达和核糖体生物合成等生物学过程。


3.LanCL2蛋白Tyr295位点磷酸化在细胞骨架和基因表达调控中起重要作用


作者使用Phos-phoSitePlus软件预测了LanCL2蛋白的磷酸化位点，发现了两个酪氨酸磷酸化位点Tyr198和Tyr295。通过慢病毒表达系统构建LanCL2 Tyr198或Tyr295突变体（LanCL2Y198A和LanCL2Y295A）的GBM细胞，发现过表达野生型LanCL2 （LanCL2wt）促进了LanCL2的入核，反之突变Tyr295位点则抑制其入核，而突变Tyr198位点作用不明显（图5）。通过磷酸化蛋白质谱分析，作者发现LanCL2蛋白Tyr198和Tyr295位点突变可调控下游一系列信号分子的磷酸化水平，包括MARCKS、Cortactin、STAT3、ROCK2、MARCKSL1、HSPB1、RPS6、AGFG1、SRRM2等。这些蛋白参与了遗传信息处理（包括DNA复制、RNA转录和转运、蛋白质翻译和降解）、信号转导（包括mTOR、ErbB、AMPK和Hippo信号通路）和生物学过程（包括细胞运动、死亡、细胞周期、细胞骨架重排）等（图5，图6）。这表明LanCL2调控的磷酸化事件在细胞运动、生长以及遗传信息加工中非常活跃。


图5. 突变LanCL2蛋白Tyr295位点抑制其转运入核。


图6. 过表达LanCL2wt、LanCL2Y198A和LanCL2Y295A的GBM细胞的磷酸化蛋白质组学分析。


4.LanCL2蛋白Tyr295磷酸化受c-Met调控，可激活Cortactin和STAT3，促进GBM细胞侵袭性伪足的形成


为了研究Tyr198和Tyr295磷酸化对于LanCL2激活中的重要性，作者进行了transwell迁移/侵袭实验、三维球体侵袭实验以及基质降解实验。结果表明，与过表达LanCL2wt组相比，突变Tyr295位点后GBM细胞的迁移、侵袭和侵袭性伪足形成能力显著降低，而突变Tyr198位点无明显变化（图7）。同时，与LanCL2wt组相比，LanCL2Y198A和LanCL2Y295A组GBM细胞的MARCKS的磷酸化水平，及Cortactin、STAT3和ROCK2的磷酸化和蛋白表达水平下降，但后者降低的程度更高（图7）。这些发现证实了LanCL2的Tyr295磷酸化对LanCL2激活和GBM细胞侵袭更为重要。作者还证实了LanCL2能与Cortactin相互结合。


作者随后利用GPS 5.0软件对LanCL2蛋白Tyr295残基的上游酪氨酸激酶进行预测，发现c-Met评分最高。特异性c-Met抑制剂PHA-665752可显著抑制GBM细胞中LanCL2的入核转运，以及c-Met、Akt、Cortactin和STAT3的磷酸化，导致GBM细胞处于不活跃和静止状态。相反，c-Met的配体肝细胞生长因子（HGF）促进了LanCL2的入核，提高了c-Met、Akt、Cortactin和STAT3的磷酸化水平（图8）。这些结果证实了c-Met是LanCL2 Tyr295位点的上游酪氨酸激酶。


图7. LanCL2蛋白Tyr295位点磷酸化对GBM细胞迁移、侵袭和侵袭性伪足形成的调控作用。


图8. c-Met是LanCL2蛋白Tyr295位点的上游激酶。


5.Tyr295突变逆转了LanCL2对动物体内GBM移植瘤生长和进展的促进作用


为进一步证实LanCL2及其磷酸化对动物体内GBM生长和进展的调控作用，作者采用立体定位技术将构建了颅内原位GBM移植瘤裸鼠模型。结果表明，过表达野生型LanCL2显著促进了GBM移植瘤的生长，而Tyr198或Tyr295突变后肿瘤生长受到抑制。Kaplan-Meier生存分析显示，对照组、LanCL2wt组、LanCL2Y198A组和LanCL2Y295A组小鼠的中位生存时间分别为44、33.5、44和49天。免疫组化结果表明，LanCL2wt组Ki67、STAT3和phospho-Akt（Thr308）表达升高，而LanCL2Y198A组和LanCL2Y295A组显著降低（图9）。这表明LanCL2可促进动物体内GBM移植瘤的生长和进展，突变其Tyr198和Tyr295位点可改善小鼠预后。


图9. LanCL2蛋白Tyr198和Tyr295磷酸化对裸鼠原位GBM移植瘤生长与进展的影响。


结论：

该研究发现下调LanCL2表达可抑制GBM细胞的迁移、侵袭和侵袭性伪足形成，反之过表达野生型LanCL2则促进之。LanCL2蛋白的Tyr295磷酸化位点对LanCL2的激活和入核，以及GBM细胞体外侵袭和体内移植瘤的生长和进展至关重要。该研究提出了c-Met/LanCL2/STAT3/Cortactin这一新的信号通路，及其调控GBM细胞侵袭和侵袭性伪足形成的作用机制，首次评价了LanCL2蛋白Tyr295磷酸化对GBM浸润生长和肿瘤进展的重要性，拓宽了人们对LanCL2活化及其核转运机制的认识，为GBM治疗提供了新的靶点。


参考文献：

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1.Diamandis P, Aldape K. World Health Organization 2016 Classification of Central Nervous System Tumors. Neurol Clin. 2018;36(3):439-47.2.Fujishita T, Kojima Y, Kajino-Sakamoto R, Taketo MM, Aoki M. Tumor microenvironment confers mTOR inhibitor resistance in invasive intestinal adenocarcinoma. Oncogene. 2017;36(46):6480-9.3.Xiao K, Tan J, Yuan J, Peng G, Long W, Su J, et al. Prognostic value and immune cell infiltration of hypoxic phenotype-related gene signatures in glioblastoma microenvironment. J Cell Mol Med. 2020;24(22):13235-47.4.Bassaganya-Riera J, Guri AJ, Lu P, Climent M, Carbo A, Sobral BW, et al. Abscisic acid regulates inflammation via ligand-binding domain-independent activation of peroxisome proliferator-activated receptor gamma. J Biol Chem. 2011;286(4):2504-16.5.Cichero E, Fresia C, Guida L, Booz V, Millo E, Scotti C, et al. Identification of a high affinity binding site for abscisic acid on human lanthionine synthetase component C-like protein 2. Int J Biochem Cell Biol. 2018;97:52-61.6.Zhao HF, Zhou XM, Wang J, Chen FF, Wu CP, Diao PY, et al. Identification of prognostic values defined by copy number variation, mRNA and protein expression of LANCL2 and EGFR in glioblastoma patients. J Transl Med. 2021;19(1):372.


全文链接：https://doi.org/10.1016/j.jare.2024.03.007



通讯作者简介


赵华福 副研究员

深圳大学第一附属医院（深圳市第二人民医院）

深圳市海外高层次C类人才，深圳福田英才，深圳市第二人民医院副研究员，安徽医科大学兼职副教授

深圳市抗癌协会神经肿瘤专业委员会委员、中国肿瘤防治联盟深圳联盟脑转移瘤专业委员会委员

2015年获得香港理工大学博士学位，2015-2018年在深圳市第二人民医院（工作站）/中山大学（流动站）从事博士后研究

专注于胶质瘤的分子靶向治疗和药物联用治疗，以及胶质瘤复发及细胞侵袭的分子机制研究。主持国家级和省级等基金项目共8项，在Molecular cancer、J Exp Clin Cancer Res、Journal of Advanced Research等国际高水平期刊发表SCI论文20余篇

黄国栋 教授

深圳大学第一附属医院（深圳市第二人民医院）

深圳大学第一附属医院（深圳市第二人民医院）国家临床重点专科/神经外科学科带头人、科主任、大外科主任。医学博士、教授、主任医师，博士生导师、博士后导师

深圳市卫生健康系统B档特聘专家。中国医师协会神经内镜医师培训基地(深圳)主任、中国医师协会内镜医师分会常委、中国医师协会神经外科医师分会委员、中国医师协会周围神经专委会委员、中国颅神经疾患/垂体瘤/转移瘤协作组委员、广东省医学会神经外科分会副主任委员、广东省医师协会神经外科医师分会副主委兼神经肿瘤专业组组长、深圳市医师协会神经外科医师分会会长、深圳市抗癌协会神经肿瘤专委会主委、深圳神经外科专科联盟理事长；《中华神经医学杂志》《中国内镜杂志》《中华神经外科杂志》《Brain Sciences Advance》等杂志编委及审稿专家

2015年获评首届深圳十佳好医生，2021年获评人民好医生特别贡献专家称号，2022获评第三届深圳医师奖

擅长神经内镜和显微技术治疗颅内各种部位、类型、难度的病变，致力于神经内镜技术的研究应用和全国推广工作，举办九届国家继教项目-深圳神经内镜手术入路解剖高级培训班，培训培养全国各地医院神经外科骨干神经内镜人才300余名

主持国家级和省市级课题十余项，发表SCI论文30余篇，中文核心论文40余篇，授权发明专利10项，获广东省、深圳市科技进步奖2项

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