四川大学生物治疗国家重点实验室的仝爱平教授团队和四川大学华西医院神经外科徐建国主任团队制备了重组抗B7-H3×CD3 biAbs，并构建了MMP-2敏感的S-biAb/dEGCG@NPs。S-biAb/dEGCG@NPs 可以通过增强铁死亡效应和增强免疫检查点阻断（ICB）免疫治疗来诱导GBM消除，并且可能成为用于增强癌症治疗的成功抗体纳米载体。结果发表于2023年4月的《ACS Nano》杂志。

——摘自文章章节

免疫治疗作为一种新兴的治疗方式，已广泛应用于癌症治疗。B7-H3 （CD276）是B7超家族的成员，与胶质母细胞瘤（GBM）患者的不良生存相关。使用单克隆抗体或双特异性抗体（biAbs）阻断 B7-H3 可能是癌症治疗中最成功的策略之一。表没食子儿茶素-3-没食子酸酯（EGCG）作为一种绿茶多酚，能够促进细胞内产生ROS并诱导生物分子的氧化损伤触发铁死亡。基于上述背景，四川大学生物治疗国家重点实验室的仝爱平教授团队和四川大学华西医院神经外科徐建国主任团队制备了重组抗B7-H3×CD3 biAbs，并构建了MMP-2敏感的S-biAb/dEGCG@NPs。S-biAb/dEGCG@NPs 可以通过增强铁死亡效应和增强免疫检查点阻断（ICB）免疫治疗来诱导GBM消除，并且可能成为用于增强癌症治疗的成功抗体纳米载体。结果发表于2023年4月的《ACS Nano》杂志。

作者基于Anti-B7H3×CD3 biab设计合成MMP -2敏感的S-biAb/dEGCG@NPs纳米材料，测定不同溶剂下S-biAb/dEGCG@NPs的稳定性及并进行了相互作用分析。通过流式细胞技术研究B7-H3和CD3的结合、细胞内ROS水平、细胞死亡，ELISA检测细胞因子，CCK-8法测定anti-B7H3×CD3 biAbs对GBM细胞系的细胞毒性，蛋白印迹检测铁死亡相关蛋白等，最后建立原位GBM肿瘤模型验证体内治疗效果并揭示体内诱导产生的免疫应答。

1. 重组Anti-B7H3×CD3 biab的结构表征

作者在构建表达载体和转染的HEK293FT细胞上清液的生产和纯化后，SDS - PAGE分析显示在约60kda出现了条带，得到了预期的anti- B7-H3×CD3 biAbs。流式分析结果显示anti-B7-H3×CD3 biAbs具有类似于抗-B7-H3单链抗体与U87细胞(B7-H3阳性)结合的高结合能力，在Jurkat细胞(CD3阳性)中，也表现出高效结合亲和力。

2. MMP-2敏感S-biAb/dEGCG@NPs的制备与表征

作者设计合成MMP -2敏感的S-biAb/dEGCG@NPs，即-HA-PLGLAG-dEGCG。MMP-2激活后，SbiAb/dEGCG@NPs转变为不规则的团聚体，而biAb/dEGCG@NPs则没有明显的变化。作者测量了MMP-2存在或不存在时biAbs的释放情况，结果约60%的biAbs释放出来，比MMP-2不敏感的纳米颗粒高。作者用不同试剂溶解材料，非离子试剂诱导了S-biAb/dEGCG@NPs的电离，而离子试剂对EGCG几乎没有影响，说明dEGCG通过疏水相互作用表现出EGCG与生物活性分子的内在结合。之后通过蛋白酶K降解实验检测S-biAb/dEGCG@NPs抗酶降解能力，证明S-biAb/dEGCG@NPs具有良好的稳定性和抗体保护作用。

3. dEGCG对IFN-γ诱导的肿瘤细胞凋亡的促进作用

蛋白印迹结果表明dEGCG显著降低GPX4的表达，而轻度抑制SLC7A11和SLC3A2的表达。体外脂质过氧化（LPO）研究显示，与其他细胞相比，dEGCG和IFN-γ共处理的U87细胞表现出更强的LPO信号，与流式细胞术定量分析结果一致。作者使用dEGCG和IFN-γ处理后的细胞线粒体表现出典型的铁死亡形态学特征（体积萎缩和线粒体嵴减少），而这一作用可以被Ferr-1逆转。综上所述，这些数据初步表明dEGCG和IFN-γ在致敏肿瘤细胞铁死亡中具有协同作用。

4. S-biAb/dEGCG@NPs 介导的T细胞激活和U87细胞铁死亡

作者将S-biAb/dEGCG@NPs在加入或不加入50 nM MMP-2的情况下预处理4小时，然后与PBMC一起孵育30分钟。被S-biAb/dEGCG@NP（带有 MMP2）激活的T细胞在 30分钟内迁移到U87肿瘤细胞周围并积累，4小时后U87细胞最终被破坏。在IFN-γ存在下，用S-biAb/dEGCG@NPs处理的U87细胞表现出比其他细胞更强的LPO信号，进一步证明了LPO的积累效应。然而，在存在铁死亡抑制剂的情况下，使用 S-biAb/dEGCG@ NP 和 IFN-γ 联合治疗可导致丙二醛量和LPO信号水平降低，证实主要通过诱导铁死亡来发挥有效的抗肿瘤功效。

5. 体内抗GBM作用

作者在携带U87-Luc GBM的NCG小鼠中研究了 S-biAb/dEGCG@NPs 的抗肿瘤功效。小鼠大脑中的生物发光信号图像和相应的定量分析显示，纳米颗粒中负载的biAbs会显著延缓GBM生长，biAb/dEGCG@NP组的MRI和H&E结果也证明了S-biAb/dEGCG@NPs可以抑制肿瘤生长，延长小鼠的生存期，期间也没有观察到小鼠体重的明显变化或对正常器官的损害。

6. 体内免疫反应

IHC分析发现在S-biAb/dEGCG@NP组中观察到比其他组更强的CD3+和CD8+ T细胞染色，biAb、biAb/dEGCG复合物、biAb/dEGCG@NP和S-biAb/dEGCG@NP组中CD4+ T细胞比例较对照组有所增加，但这四组之间没有显着差异。在本研究中，S-biAb/dEGCG@NP组中浸润CD8+ T细胞数量最高，S-biAb/dEGCG@NP组中CD8+/CD4+比率为1.9-5.2比其他组高出一倍，这一增加的比率预示着更长的生存期。高CD8+/Treg 比率与癌症患者良好的预后和改善的生存率相关。检测结果表明，S-biAb/dEGCG@NP 组的CD8+/Treg比率为分别比 biAb/dEGCG@NP、biAb/dEGCG 复合物、biAb 和对照组高1.5、1.8、1.7，5.9倍，并且这种增加的比率导致了良好的抗GBM效果。

组稿

徐涛 副教授

海军军医大学附属长征医院

编译

马超 医师

安徽医科大学第二附属医院

终审

徐涛 副教授

海军军医大学附属长征医院