在本研究中，首先通过计算单个药物的IC50值，初步确定替莫唑胺（TMZ）和白蛋白紫杉醇（ABX）联合用药的体外浓度。其次，TMZ和ABX联合在两个GBM细胞系（U87-MG、LN229）和GBM患者原代细胞（G353、G393）中观察协同抗肿瘤作用，随后探究GBM细胞中对DNA损伤和铁死亡的分子机制。最后，建立了GBM患者来源的类器官(PDOs)，以确认两药联合的临床前应用前景。

研究表明， TMZ与ABX序贯或同步联合均对GBM细胞有显著的抑制作用，特别是同步联合治疗时疗效更佳；

在特定浓度下，TMZ和ABX联合作用导致GBM细胞的CI值小于1(图1a)，表明ABX和TMZ之间存在协同作用。同时设计了6个不同的实验组，包括对照组、单独使用TMZ组、单独使用ABX组、前置ABX-TMZ组(在TMZ治疗前24 h进行ABX预处理的顺序治疗组)、TMZ-后ABX组(在TMZ治疗后24 h进行ABX预处理的顺序治疗组)和同时使用TMZ+ABX治疗组。如图1b所示，与TMZ单药治疗相比，preABX-TMZ组和ABX与TMZ同时治疗组均显著降低了GBM细胞活力。而且与序贯组相比，同步联合组疗效更优（图1c）。

图1：GBM细胞系U87-MG, LN229和原代GBM细胞G353 ，G393中作用

小鼠体内同样证实，TMZ联合ABX增加对GBM细胞抑制效果

小鼠GBM模型中（图2a），药物治疗2周后， TMZ联合ABX组颅内荧光强度显著降低，特别是ABX high组，表明两药联合显著抑制GBM肿瘤细胞（图2b）。K-M生存分析结果也显示ABX联合TMZ组生存更优，特别是ABX high组（图2c）。

图2：GBM小鼠模型中生存结果

TMZ与ABX联合增加了DNA损伤（γ-H2AX蛋白表达上调）并阻碍DNA损伤修复

（γ-H2AX蛋白：H2A的变体，细胞损伤时第139位丝氨酸磷酸化，表达上调，被广泛用作DNA双链断裂（DSBs）的标记，来指示双链DNA损伤和凋亡）

Western Blotting结果显示，与TMZ单独处理和对照组相比，序贯和同步应用TMZ和ABX处理均显著增加了GBM细胞中y-H2AX蛋白的表达(图3a)。后续进行了彗星试验，以检测单个细胞的DNA损伤。结果显示，TMZ和ABX联合处理显著诱导GBM细胞DNA损伤，表现为尾部和尾部时刻DNA百分比的增加(图3b、c和d)，表明TMZ和ABX联合处理可增强DNA损伤。

图3 TMZ与ABX联合增加了DNA损伤

TMZ与ABX联合治疗干扰核修复蛋白ERCC1和XPC的表达从而抑制DNA损伤修复功能（C：细胞质，N：细胞核； DNA损伤修复主要发生在细胞核内）

此外，还评估了在指定治疗后GBM细胞DNA损伤修复的能力。为了监测DNA损伤修复的进展，用TMZ或TMZ+ABX处理GBM细胞48小时。药物洗脱后，将细胞保存在正常培养基中，在药物去除后的不同时间点(0、6、12、24和48小时)用免疫荧光检测细胞核中γ-H2AX的表达情况。结果表明，在与单一TMZ处理组相比，加ABX处理组y-H2AX水平维持在基础水平以上的时间更长，表明持续的DNA损伤(图4a)。通过体内y-H2AX免疫组化染色进一步证实了上述发现。结果证实，与其他组相比，TMZ和ABX联合治疗显著DNA损伤修复。

图4 TMZ与ABX联合抑制DNA损伤修复

ERCC1和XPC是DNA损伤修复通路的重要蛋白，研究发现，TMZ联合ABX抑制细胞核ERCCA和XPC蛋白的表达，从而抑制DNA损伤修复通路（图4e）。免疫荧光发现这两个蛋白定位于细胞核（图4f）。

图4 TMZ与ABX联合抑制DNA损伤修复

TMZ联合ABX通过上调HO-1和下调GPX4蛋白促进了肿瘤细胞铁死亡（HO-1：血红素加氧酶，一种调节因子，参与氧化应激反应）

铁死亡：当细胞胱氨酸运输蛋白受到抑制，胞内谷胱甘肽（GSH）会被耗尽，最终导致谷胱甘肽过氧化物酶（GPX4）的失活，导致脂质过氧化积累，达到一定程度即可诱发细胞死亡，GPX4酶受到抑制也可以直接导致这一作用。

脂氟、亚铁(Fe2t)和谷胱甘肽(GSH)是检测铁下垂最常用的指标。对于活细胞成像，我们观察到，与TMZ单独处理相比，TMZ和ABX联合处理后，GBM细胞细胞质中Fe2+(图5a)和脂质活性过氧化氢(图5b)显著积累。与单独处理相比，TMZ和ABX联合治疗导致细胞内GSH水平显著降低(图5c)。在蛋白质层面分析中，通过Western Blotting检测GPX4和HO-1蛋白的表达水平，发现与其他组相比，联合治疗的GBM细胞中GPX4表达显著下调，HO-1表达显著上调(图5d)。

图5. TMZ与ABX联合促进细胞铁死亡

类器官组织培养模型亦看到TMZ联合ABX通过增强DNA损伤发挥抑制肿瘤作用（联合治疗对于IDH1/2和ATX突变型胶质瘤敏感性更高）

在三种PDO模型中，TMZ联合ABX显著抑制了类器官模型细胞（图6c、d）；对包括16名患者的GBM PDO队列进行药物治疗敏感性试验发现由ABX和TMZ组成的联合治疗方案使80%以上的GBM病例(n=13)的抑制率得到改善，其中约37.5%的GBM病例(n=6)的抑制率改善幅度超过2倍(图6f)。联合治疗组的平均抑制率明显高于TMZ单药治疗组(图6g)；

对PDOs队列中遗传背景与应答率之间的相关性进行了分析发现，IDH1/2或ATRX突变的GBM患者对ABX和TMZ联合治疗的反应接近100%(图6h)，这表明这种特殊的遗传谱可能受益于这种治疗方案，为后续治疗提供支持。

图6.类器官培养结果

TMZ联合ABX通过下调细胞核蛋白XPC和ERCC1的表达抑制DNA损伤修复，同时调节HOXM1和GPX4的表达来增强铁死亡，从而增强TMZ肿瘤抑制能力。

目前，TMZ联合TTFields更是被NCCN指南推荐为优选1类。但临床中接受TMZ不可避免的会发生耐药。白蛋白紫杉醇（ABX）是一种白蛋白结合的微管稳定剂，具有较好的血脑屏障透过性。我们的研究较全面的证实了TMZ联合ABX通过诱导DNA损伤、抑制DNA损伤修复、促进铁死亡从而增强抗肿瘤疗效。为TMZ临床耐药提供了有效的解决方案，同时类器官模型更加证实了临床可行性。另外在用药方式上我们的研究也证明了相比于序贯治疗同步联合疗效更佳。TTFields联合TMZ是目前的一线优选方案，有研究表明TTFields可通过下调BRCA , ATRIP, MLH1, MRE11A, FANCM和FANCD2等DNA修复蛋白，延缓DNA损伤修复；同时干扰了复制分叉的进展并诱导了复制应激，从而抑制DNA损伤修复，是临床中另一种可选的TMZ增敏的好拍档。随着更多临床研究的进展和突破，相信未来会有更多可选的联合治疗方案能够解决或者延长耐药问题的发生，更好的惠及患者，延长GBM患者的生存。