蛋白质组学和代谢组学分析的工作流程
胶质母细胞瘤（GBM）样本取自2021年10月至2022年12月接受厦门大学第一附属医院伦理委员会批准的手术的GBM患者。对照组白质样本（n=8）均来自中国脑库中心（CBBC）。MGMT启动子甲基化水平由乐兰生物科技有限公司（Cheerland Biotechnology Co., Ltd）测定。所有入组样本均接受二代基因测序（NGS）来测定MGMT基因表达量。本研究使用对照组的8个人类白质样本、8个胶质母细胞瘤（GBM）样本和8个MGMT阳性GBM样本进行蛋白质组学和代谢组学分析，基线数据如表1所示。
表1
结果
图1直观显示了本研究中蛋白质组学和代谢组学分析的工作流程，即：使用Pierce™ TOP Abundant Protein Depletion Spin Column去除脑组织中丰度最高的蛋白质（HAP）。然后，使用基于胰蛋白酶的FASP消化HAP删除的脑样本。对于蛋白质组学实验，所有消化的肽都用iTRAQ试剂标记，并使用Q Exactive HFLC-MS/MS仪器（Thermo）。然后，使用MaxQuant软件在人类UniProt数据库中搜索所有质谱，并进行生物信息学分析。对于代谢组学分析，采用配备二元溶剂输送管理器的沃特世UPLC I-class系统在肽消化后进行基于非靶向液相色谱-质谱的代谢组学分析。所有原始数据均在OPLS-DA之前使用MaxQuant软件进行分析并使用MaxQuant软件进行处理。应用Ingenuity Pathway Analysis软件探索与差异表达的代谢物和蛋白质相关的代谢途径。
图1
人类白质和GBM样本的蛋白质组学分析
图2
图3显示了这项研究中列出的20种富集的GO生物过程，包括10种下调的蛋白质（上图）和10种上调的蛋白质（下图）。生物过程（BP）分析表明许多蛋白质参与氧运输、细胞氧化剂解毒、核糖体生物合成和核糖核蛋白复合物组装（图3A-C和表S4）。细胞成分（CC）类别中的大量蛋白质与核糖体、血红蛋白复合物和线粒体呼吸体有关（图3A-C和表S5）。此外，分子功能（MF）类别中的大多数蛋白质主要与核糖体的结构成分、过氧化物酶活性、氧化还原酶活性、触珠蛋白结合、抗体活性和氧载体活性有关（图3A-C和表S6）。KEGG通路的富集表明，这些失调蛋白主要与沙门氏菌感染、剪接体、氧化磷酸化和疟疾有关（图3D-F和表S7）。
同时，本研究对GBM vs. CON组中2745个上调蛋白和969个下调蛋白进行了GO和KEGG通路富集分析。与GBM组相比，CON组中总共有4307个BP、3863个CC、1992个MF和204个KEGG通路术语显着富集。前20个富集的BP、CC、MF（图3A）和615 KEGG通路术语（图3E）。BP分类分析表明，大多数蛋白质参与黑质发育、核糖体生物发生的建立或维持、核糖核蛋白复合物组装、细胞质翻译、细胞极性和蛋白质聚合的调节。CC分类分析表明，大多数蛋白质与核糖体、核糖体亚基、剪接体复合物、微管相关复合物、主轴突和髓鞘有关。同时，MF分析表明，大多数蛋白质与核糖体结构成分、rRNA结合、核糖核蛋白复合物结合、镁离子结合、细胞骨架结构成分和微管结合有关（图3A）。KEGG通路分析显示，失调蛋白主要与沙门氏菌感染、运动蛋白和核糖体有关（图3D）。
此外，本研究还对GBM组与MGMT组中131个上调蛋白和299个下调蛋白进行了GO和KEGG通路富集分析。我们的结果表明，与MGMT组相比，GBM组中的392 BP、683 CC、1019 MF和448 KEGG通路术语显着丰富。BP分类分析表明，大多数蛋白质参与氧运输、细胞氧化剂解毒、气体运输、线粒体电子运输、质子动力驱动的ATP合成和ATP生物合成过程。CC分类分析显示大部分蛋白与血红蛋白复合物、触珠蛋白-血红蛋白复合物、Box C/D RNP复合物、线粒体呼吸链复合物I、NADH脱氢酶复合物和呼吸链复合物I相关。同时，MF分析显示大多数蛋白质与过氧化物酶活性、氧化还原酶活性、触珠蛋白结合、NADH脱氢酶（泛醌）活性、NADH脱氢酶（醌）活性和NADH脱氢酶活性有关（图3B）。KEGG通路分析显示，失调的蛋白质主要与氧化磷酸化、逆行内源性大麻素信号传导、疟疾、中性粒细胞胞外陷阱形成和氨基酸生物合成有关（图3E）。
人体白质和GBM样本的代谢组学分析
图5对对照组、GBM组和MGMT组进行了代谢组学分析。差异分析显示，与CON组相比，GBM组中有864种上调和665种代谢物下调（图5A）。对这两组中1529个失调代谢物的基于热图的聚类的进一步分析反映了与CON组相比GBM中可能的反应（图5B）。值得注意的是，Cynarasaponin J和Fisetinidol的水平最显着，FC分别为0.00010151和8599.5。CON组与GBM组的正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）结果如图5C所示。与CON组相比，GBM组失调的代谢物主要富集于甘油磷脂代谢、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢以及花生四烯酸代谢（图5D和表S8）。差异分析显示，与GBM组相比，MGMT组中有187种上调和147种代谢物下调（图5E）。对这两组中334种失调代谢物的进一步基于热图的聚类分析反映了MGMT组与GBM组相比可能的反应（图5F）。此外，OPLS-DA显示，与CON vs. GBM组相比，GBM vs. MGMT组的代谢组学图谱发生了很大变化（图5C，G）。与GBM组相比，MGMT组失调的代谢物主要富集于甘油磷脂代谢、鞘脂代谢和酪氨酸代谢（图5H和表S9）。
联合分析差异表达蛋白和差异代谢物
在本研究中，在CON与GBM组对中发现了571种代谢物和3714种蛋白质，图6是使用Ingenuity Pathway Analysis（IPA）软件对差异表达的蛋白质和代谢物进行综合分析的结果。与CON组相比，叶酸、核糖体和剪接体组成的一碳库在GBM中发挥着关键作用（图6A和表S10）。此外，在GBM与MGMT组对中发现了150种代谢物和430种蛋白质，并使用IPA软件对差异表达的蛋白质和代谢物进行综合分析。结果表明，与GBM组相比，MGMT组中酮体的合成和降解、甘油磷脂代谢和脂肪酸降解发挥着关键作用。此外，结果显示MGMT组中有94个上调和19个下调的蛋白质以及20个上调和16个下调的代谢物与DNA修复相关（图6B和表S11）。此外，还进行了综合代谢组学和蛋白质组学分析，在MGMT组和GBM组中鉴定出了六种关键蛋白，即DENN结构域包含3、Ras蛋白特异性鸟嘌呤核苷酸释放因子2（RasGRF2）、钾电压门控通道亚家族Q成员2、sproutyRTK信号拮抗剂2、unc-5 netrin受体C和谷胱甘肽S-转移酶α1。然后，三个关键途径，包括酮体的合成和降解、甘油磷脂代谢和脂肪酸降解，被认为是识别GBM患者样本中MGMT启动子非甲基化GBM和MGMT启动子甲基化阳性GBM的潜在生物标志物，曲线下面积分别为0.7895、0.7326和0.7026。
讨论
后记
第一作者简介
陈曦 副主任医师
厦门大学附属第一医院
医学博士，神经外科副主任医师
厦门市高层次人才
厦门大学硕士研究生导师、助理教授
美国匹兹堡大学医学院（UPMC）颅底外科中心公派访问学者
国家神经疾病医学中心脑胶质瘤MDT专科联盟第一届理事会理事
福建省中西医结合学会神经外科分会委员
福建省海峡医药交流协会神经微侵袭治疗专业委员会委员
厦门市中西医结合学会神经外科学分会委员
厦门大学附属第一医院垂体瘤、胶质瘤多学科联合诊治团队（MDT）成员
2018年度厦门大学附属第一医院“十佳医生”
擅长神经内镜下经鼻蝶垂体瘤微创手术治疗及后续标准化治疗；脑胶质瘤以及其余中枢神经系统肿瘤的规范化手术、放化疗及靶向治疗
主持福建省自然科学基金项目2项，福建省卫计委青年科研课题1项，厦门市科技计划项目1项
第一作者/通讯作者发表文章20余篇
通讯作者简介
谭国伟 教授
厦门大学附属第一医院
神经外科科主任，教授、主任医师、硕士研究生导师
厦门市（省级）领军人才
国家神经疾病医学中心脑胶质瘤MDT专科联盟第一届理事会理事
中华医学会核医学分会PET/MR脑功能成像工作委员会委员
世界华人医师协会、世界华人神经外科协会脊柱脊髓专业委员会委员
中国中西医结合学会常务委员
中国抗癌协会神经外科肿瘤专业委员会第一届中枢神经系统淋巴瘤学组委员
中国研究型医院学会神经微侵袭治疗专业委员会常务委员
中国医药教育协会神经外科专业委员会委员
中国神经外科重症管理协作组第三届委员会委员
福建省中西医结合学会副主任委员
福建省抗癌协会神经肿瘤专业委员会常务委员
福建省医学会器官移植学分会第三届委员会常务委员
厦门市医学会神经外科分会第三届委员会副主任委员
厦门市医师协会神经外科医师分会第一届委员会委员兼总干事
中华神经创伤外科电子杂志编委、《中华脑科疾病与康复杂志（电子版）》编委、《中国卫生标准管理》杂志福建省编辑委员会特约编委、《中国脑科疾病与康复杂志（电子版）》编辑委员会委员
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