意大利帕多瓦大学分子医学系的Martina Castellan等使用单细胞数据集，识别GSC的基因调控网络，确定GSC位于GBM分化阶段的顶端，并发现YAP/TAZ是GSC的关键分子引擎。结果发表于2021年2月的《Nature Cancer》杂志。

——摘自文章章节

通过ARACNE和VIPER等一系列算法，最后筛选出转录共激活因子YAP和WWTR1（即TAZ）。作者在GBM中敲除YAP/TAZ，验证YAP/TAZ活性与GSCs之间的关系；通过免疫组化（IHC）对人GBM切片中活化的TAZ进行定量。

为阐明胶质瘤形成的早期步骤，将编码PDGFR-α、EGFR或HER2致癌基因活化的慢病毒载体转导至新生小鼠星形胶质细胞中，同时包括编码致癌KRasG12V加上针对p53的短发夹（sh）RNA或针对NF1和p53的shRNA。用YAP/TAZ敏感的慢病毒8xGTIIC-RFPDD转导至早期星形胶质细胞；然后在癌基因介导的重编程过程中监测红色荧光蛋白（RFP）的表达，从而验证YAP/TAZ是否在获得GSC样状态时被致癌突变激活。从新生的R26CAGCreERT2、Yapfl/fl、Tazfl/fl小鼠中分离出星形胶质细胞，通过4OH-TAM（4OH-TAM）处理Cre激活后，诱导YAP/TAZ的遗传消融，验证癌基因介导、将正常细胞重编程为GSC样细胞是否需要YAP/TAZ。作者进一步用RNA-seq对Yapfl/fl、Tazfl/fl小鼠星形胶质细胞进行转录组分析，通过使用HER2CA显著改变表达的基因对样本进行分层聚类，从而在分子水平上研究了YAP/TAZ如何促进正常神经细胞向GSC的致癌重编程。

最后，作者在免疫缺陷小鼠大脑原位注射GBM细胞，使用转化的Yapfl/fl、Tazfl/fl细胞携带shNF1/shp53或KRasG12V/shp53和双荧光素酶-gfp表达载体；在免疫能力强的同基因小鼠大脑中注射表达抗YAP/TAZ强力霉素诱导shrna的GL261或CT2A，验证YAP/TAZ是否是GSCs在体内的主要特征之一，即肿瘤起始所必需的。

该研究结果表明，单细胞测序的拟时序分析可以识别早期的GSC。当关注不同亚型GBM（如前神经、经典或间充质）时，G-STEM总是在伪时间轨迹开始时富集,显示所有GBM亚型的GSC样细胞都具有G-STEM特征。Kaplan-Meier生存分析,得出G-STEM特征代表一种新的转录程序，该特征在GBM分化层次处于顶端的早期GSC中。

对GSC进行评分分析，发现YAP/TAZ活动是定义GSC状态的一个首要因素。当YAP/TAZ野生型肿瘤持续扩大时，敲除YAP/TAZ会抑制肿瘤生长，这与肿瘤致瘤细胞群中GSC缺失的结果一致，YAP/TAZ是维持GSC状态所必需的。在体内，这种状态是由YAP/TAZ依赖的G-STEM信号识别。通过免疫组化和检测Ivy Atlas的坏死区，表明GBM坏死周围区域确实有GSC富集，G-STEM的表达峰值与TAZ峰值区域一致。

新生小鼠的星形胶质细胞中引入活化的致癌基因后，RAS/RTK致癌基因过表达将其转化为具有GSC特性的细胞，在体内外具有致瘤和自我更新的能力。RNA-seq分析发现，肿瘤显示出G-STEM特征高表达，而DGC特征表达降低。荧光监测表明，YAP/TAZ激活是正常星形胶质细胞重编程为致瘤性gsc样细胞的早期事件，YAP/TAZ在GBM起始过程中的主要功能是抑制分化，促进获得干细胞样特征。在人GBM细胞中，分化/去分化方案证实YAP/TAZ为GBM细胞内在分化所必需，YAP/TAZ消耗可诱导干细胞球逐步分解和消亡；在分子水平上研究YAP/TAZ消融的结果表明，YAP/TAZ在GSCs中主要作用在于阻止其神经元谱系分化。

通过生物发光和组织学分析发现，将亲代GBM细胞注射到小鼠颅内后，可形成侵袭性强的较大肿瘤团块。相比之下，YAP/TAZ敲除细胞未能成瘤；在免疫功能缺陷小鼠中结果类似，证实YAP/TAZ对于肿瘤的发生和体内分化都是必需的。

总之，通过重建GSC的调控网络，作者发现YAP/TAZ共激活是干细胞状态的主要调节因子，而与GBM亚型无关；YAP/TAZ激活是GSC分化的主要障碍。该研究在GSC原生状态的关键分子基础上取得进展，揭示恶性脑胶质瘤治疗的新思路。