该团队前期研究中，采用首创的统计学分布理论—广义超几何分布（https://arxiv.org/abs/1808.06924；https://arxiv.org/abs/2208.14939），筛选出了高度可靠的缺氧调控分子集合（SR-HRG），构建了相应的缺氧调控分子网络（GBM-HRG-MINW），并发现该网络具有特殊的代数拓扑学性质（https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31203532/）。在这些前期研究的基础之上，由于转录因子（transcriptional factor, TF）调控生物学过程的重要性，该团队进一步研究了调控该分子网络的关键转录因子。

首先，在mRNA、蛋白及临床标本等多个层面，分析了缺氧调控的靶点。通过筛选分析全体人类转录因子的下游调控分子，发现CEBPD是调控GBM缺氧调控分子网络最重要的一个转录因子（图1）。

图1. 显示CEBPD是影响胶质瘤缺氧调控分子网络（GBM-HRG-MINW）最重要的一个转录因子。

CEBPD在胶质瘤标本中高表达，且在4级GBM中的表达量显著高于正常脑组织和低级别胶质瘤，提示其可能具有促进胶质瘤进展的能力。从临床角度，CEBPD表达高的GBM患者其生存期更短。作为缺氧调控的关键转录因子，在临床标本及体外的细胞学实验中，均发现CEBPD在缺氧环境下表达升高，并且缺氧诱导因子HIF1α可直接结合在CEBPD的启动子区域并激活其表达，这说明缺氧环境可诱导CEBPD的表达（图2）。

进一步，采用慢病毒在胶质瘤细胞系中抑制CEBPD表达之后，可显著抑制胶质瘤细胞的生长及侵袭能力（图3），并可抑制胶质瘤在动物模型中的体内肿瘤生长能力（图4）。特别值得注意的是，缺氧可促进胶质瘤细胞的侵袭能力，且此过程受到CEBPD的正向调控。另外，在颅内种植的移植瘤中，也证实了CEBPD可正向调控胶质瘤向正常脑组织的浸润能力（图4）。

接下来，开始探讨CEBPD促进GBM致瘤性和浸润性的分子机制。为此，采用蛋白组学，研究了在胶质瘤细胞中抑制CEBPD的表达之后，有哪些蛋白被明显抑制，以及这些蛋白都具有什么功能？结果发现，受到CEBPD调控的蛋白中，其最显著的功能是参与了细胞外基质（ECM）及与其受体的相互作用、EGFR/PI3K-AKT信号通路激活等。并且，这些蛋白中的大多数在缺氧环境下表达上调（图5）。

蛋白质组结果提示EGFR及PI3K-AKT通路是CEBPD的重要下游靶点，而EGFR/PI3K通路又是GBM中发生改变的三大核心通路之一。因此，接下来深入分析了CEBPD对该通路的影响。有趣的是，CEBPD对EGFR总蛋白的表达量影响并不显著，而对磷酸化的EGFR（p-EGFR）具有显著影响。另外，抑制CEBPD表达后，可显著抑制PI3K/AKT通路的激活（图6）。那么CEBPD是如何影响EGFR的磷酸化的呢？结合上述的分析（图5），ECM及受体是CEBPD的重要下游靶点，而人们已知ECM-受体，特别是FN1-integrin相互作用，是引起EGFR磷酸化及下游PI3K/AKT通路激活的重要因素。在蛋白质组学研究中，抑制CEBPD后FN1是受到抑制最明显的蛋白之一（图5A）。接下来，作为转录因子，进一步采用Chip-seq分析，探索了CEBPD可结合在哪些基因的启动子。这个结果表明，FN1启动子区域具有大量的CEBPD结合位点（图6D），这进一步支持FN1是CEBPD的一个直接调控靶基因。这个猜想通过Chip-qPCR及荧光酶报告实验得到了证实。进一步，在抑制CEBPD表达的基础上，无论是FN1活性片段还是FN1受体（α5β1 integrin, ITGA5和ITGB1）激动剂，均可挽救被抑制的EGFR磷酸化及下游PI3K-AKT信号通路的活性，且可挽救被抑制的胶质瘤细胞侵袭能力（图6I, J）。因此，FN1是CEBPD的一个直接调控基因，并且促进了下游的EGFR磷酸化和PI3K-AKT信号通路的激活。

最后，上述的实验结论主要在胶质瘤细胞模型中发现，那么这种调控机制在实际的胶质瘤样本中是否存在？为此，进一步分析了胶质瘤样本中，CEBPD与缺氧调控因子及上述EGFR/PI3K-AKT信号通路的关系。结果发现，在临床样本中，CEBPD与这些分子的表达水平正相关。具有特别意义的是，在通路活性而非基因表达的层面，CEBPD也与HIF1α或PI3K-AKT的通路活性呈正相关（图7）。并且，这些相关性在缺氧的标本中更为明显。因此，这些结果支持上述的CEBPD调控机制在实际的胶质瘤样本中是存在的，从而为针对CEBPD的治疗策略提供了进一步的依据。