四川大学华西医院的张跃康教授等通过二代、三代空间转录组测序和单细胞去卷积分析DMG和GBM，以解码生态系统并确定不同胶质瘤分区中的特定调控程序，揭示DMG和GBM空间特异的转录剪接特征、细胞组成和微环境调控机制。文章发表于2023年2月的《Nature Communications》在线。
——摘自文章章节
【Ref: Ren Y, et al. Nat Commun. 2023 Feb 23;14(1):1028. doi: 10.1038/s41467-023-36707-6.】
恶性胶质瘤，包括H3K27M突变型弥漫性中线胶质瘤（diffuse midline glioma-H3K27M mutant，DMG）和胶质母细胞瘤（glioblastoma，GBM），是常见和致命的原发性脑肿瘤。两者在发病年龄、解剖位置和遗传学存在差异，但预后均非常差，经手术和化疗或放疗的标准治疗，中位总生存期为9-14个月，治疗失败的主要原因，包括高度异质性及浸润性生长。
DMG和GBM的异质性主要由不同的遗传或表观遗传驱动因素决定，包括转录程序和肿瘤微环境等。胶质瘤细胞存在于分区的空间隔离区域内，分区与肿瘤生长和抵抗治疗密切相关，因此，在空间环境中描述这些分区的特征非常重要。空间转录组学（spatial transcriptomics）的发展为研究空间区域的肿瘤异质性提供新手段。四川大学华西医院的张跃康教授等通过二代、三代空间转录组测序和单细胞去卷积分析DMG和GBM，以解码生态系统并确定不同胶质瘤分区中的特定调控程序，揭示DMG和GBM空间特异的转录剪接特征、细胞组成和微环境调控机制。文章发表于2023年2月的《Nature Communications》在线。
该研究收集5个DMG、3个IDH野生型原发性GBM（GBMIDHwt）、2个IDH突变型继发性GBM（GBMIDHmut）以及1份肿瘤周围样本。其中，9例有TP53突变。仅在DMG样本中发现H5K5M突变。使用10X Visium平台对相同的组织切片分别进行短读和长读空间转录组测序（spatial transcriptomic sequencing，ST-seq），建立空间分辨基因和亚型表达的数据集。
结果获得26460个空间测序单元（spot）；利用染色体数变异（chromosome number variations，CNV）筛选和分析包含肿瘤细胞的spot。通过分析，鉴别出四种基因表达模块，确定其对应的肿瘤空间结构：肿瘤核心区（富集与正常胶质发生和胶质瘤发生相关的基因）、富血管区（富集与血管生成和内皮细胞相关的基因）、肿瘤侵袭区（富集神经元和突触相关基因）和缺氧坏死区（富集参与缺氧和应激反应的基因）。这些分区与病理学特征高度吻合。
RNA亚型多样性包括，CHI3L1和Tomm6（线粒体外膜202的转位酶）的差异富集。CHI3L1的长（CHI201L3-1）和短（CHI205L3-1）亚型在缺氧坏死区与肿瘤侵袭区中差异富集。Tomm6的长（Tomm6-201）和短（Tomm6-6）亚型在缺氧坏死区与肿瘤侵袭区中差异富集。
使用牛津纳米孔技术（Oxford Nanopore Technology，ONT）对带有空间条码的cDNA进行三代长读测序，鉴定空间区域特异的转录本表达，发现同一基因在不同肿瘤空间结构中的可变剪接模式。所有四个分区都有很大部分的星形胶质细胞、血管和免疫细胞（包括周细胞或内皮细胞、小胶质细胞或巨噬细胞和B细胞）富集在缺氧坏死区和富血管区内；少突胶质细胞前体细胞（oligodendrocyte precursor cells，OPCs）在肿瘤核心区含量最高，而神经元含量在侵入性分区最高。通过对既往已报道的DMG单细胞数据进行重新分析，验证DMG存在放射状胶质样（RG-like）细胞群，为肿瘤干细胞。RG-like细胞在DMG和GBM内富含神经元的肿瘤侵袭区富集。
RG-like细胞的分区特异性调控程序研究发现，OPCs标志物OLIG2、SOX9和细胞周期基因CDK1、MKI67在肿瘤核心区的表达最高（早期峰值），而神经元标志物ZIC1、GABRA1和成熟少突胶质细胞标志物MBP在正常颗粒神经细胞层（normal granular-neuron cell layer，GCL_N）的表达最高（晚期峰值）。颗粒神经细胞层的远端位置（distant location in the granular-neuron cell layer，GCL_TI）特异性上调RG标志物TNC、HOPX、PTPRZ1和VIM、星形胶质细胞标志物CLU、LGALS1以及参与迁移和胶质瘤网络形成基因，如CD44、SPARC和GAP43。这些基因统称为GCL_TI特征。交叉分析显示，四分之一的GCL_TI特征基因与RG样细胞的标记基因重叠。这些基因的高表达与TCGA-GBM队列的预后不良相关，表明这些基因可能在侵入性分区中富含神经元的微环境内调节RG样细胞发挥作用。在GCL_TI和RG-like细胞内均高表达的基因中，FAM20C与患者预后不良相关。通过基因编辑构建Tp53敲除、H3K27M和PDGFRa D842V过表达的突变人神经干细胞系HPT hNSC，并原位移植至免疫缺陷鼠脑干建立人鼠嵌合DMG发生模型。比较FAM20C敲除和野生型HPT hNSC在体外与人或鼠神经元共培养条件下侵袭、生存以及体内成瘤情况，证实FAM20C是调控RG-like细胞在肿瘤微环境中侵袭性生长的重要基因。
综上所述，恶性脑胶质瘤存在空间异质性；DMG中存在RG-like细胞，并在富神经元侵袭区富集；FAM20C是调控RG-like细胞在肿瘤微环境中侵袭性生长的重要基因。上述研究结果为理解DMG和GBM的空间结构和分区特异性脆弱性提供基础，并为未来胶质瘤分区和生态系统的功能研究开辟新途径。
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