替莫唑胺诱导的鸟嘌呤突变对耐药性胶质瘤的预后影响

美国西北大学范伯格医学院的Deanna M. Tiek等利用靶向G4s小分子以及剪接调节激酶，研究TMZ耐药胶质瘤中的DNA和RNA变化，证实EWSR1可作为TMZ耐药的生物标志物，AS调节剂可能是有潜力的二线治疗药物。文章发表于2022年6月的《Science Advances》在线。

——摘自文章章节

【Ref: Tiek DM, et al. Sci Adv. 2022 Jun 24;8(25):eabn3471. doi: 10.1126/sciadv.abn3471. Epub 2022 Jun 22.】

研究背景

胶质母细胞瘤（GBM）是中枢神经系统中最常见的原发性恶性脑肿瘤，中位生存期仅14-16个月。替莫唑胺（TMZ）是FDA批准的治疗GBM的一线药物。TMZ通过向DNA添加诱变加合物（主要是O⁶-甲基鸟嘌呤）导致DNA损伤。但损伤的DNA可以DNA修复酶甲基转移酶（MGMT）修复，致使药物失效，该耐药性的发生与MGMT启动子去甲基化的发生有关。TMZ优先靶向鸟嘌呤（G），G4s和RNA剪接（splice）位点是富含G、功能重要的两个结构。研究表明，G4s是c-MYC、KIT、KRAS基因的重要调控元件，G4s的改变会解除RNA可变剪接（AS）的调节，因此G4s可能是恶性肿瘤的药物靶标。RNA的AS改变在GBM中普遍存在，其中FET蛋白家族（如FUS、EWSR1和TAF15）在AS加工修饰中意义重大。美国西北大学范伯格医学院的Deanna M. Tiek等利用靶向G4s小分子以及剪接调节激酶，研究TMZ耐药胶质瘤中的DNA和RNA变化，证实EWSR1可作为TMZ耐药的生物标志物，AS调节剂可能是有潜力的二线治疗药物。文章发表于2022年6月的《Science Advances》在线。

研究方法

作者为确定鸟嘌呤（G）突变在TMZ耐药性中的作用，对TMZ敏感的GBM细胞系（42WT）进行全基因组测序（WGS），结果表明获得性TMZ耐药GBM细胞（42R）相对于TMZ敏感细胞的突变负荷显著增加，固有TMZ耐药GBM细胞（T98G）的突变负荷与获得性TMZ耐药细胞相当。进一步分析表明，G＞A和C＞T点突变在TMZ抗性细胞中最为丰富，并很容易地检测到G4s。用TMPyP4（一种G4稳定药物）处理42R和T98G细胞以及正常人星形胶质细胞（NHA）后，42R耐药细胞系中诱导显著的G2/M期阻滞和细胞增殖减少，亚G1期分数增加，但对细胞周期曲线的影响最小，并且在TMZ敏感细胞系中的生长略有下降。以上数据支持G4s干扰G突变在TMZ耐药GBM中具有功能性和潜在靶向性选择性作用。

研究结果

G4s在核仁中含量丰富，通过GLASS数据和免疫荧光分析，急性TMZ治疗（42WT+TMZ）和内源性耐药（T98G）均导致核仁体积显著增加，而核仁的圆形度显著降低，TMZ抗性细胞系显示核仁R环积累显著增加，而不是与正常DNA损伤反应相关的离散核质斑点。TMZ诱导G4s突变会引起核仁变化。WGS分析进一步发现TMZ耐药细胞中富含G的剪接位点突变显著增加，为量化TMZ耐药与敏感性细胞中剪接事件的变化，作者进行纳米孔cDNA测序，然后进行Illumina验证；发现TMZ耐药性GBM细胞中的剪接位点突变与TMZ抗性细胞中增加的外显子和亚型变化相关。

通过Western blot和测序，作者发现与TMZ敏感细胞相比，获得性和固有TMZ耐药性GBM细胞中CLK2蛋白表达显著增加，但TMZ敏感细胞的急性TMZ处理没有增加CLK2蛋白表达。这些数据使CLK2抑制剂作为TMZ耐药细胞增殖的潜在策略。之后，作者使用GW807982X（CLK2i，一种CLK2抑制剂）处理TMZ耐药细胞，发现耐药细胞SR磷酸化减少，并导致显著的G2/M细胞周期阻滞，细胞增殖减少，选择性地增加TMZ耐药细胞的凋亡。

基于在TMZ耐药性GBM细胞中观察到G4s、核仁和剪接的调控，作者试图识别TMZ耐药和CLK2i疗效的指标。EWSR1可结合DNA G4结构，在DNA损伤后重新定位到核仁，并在剪接和DNA损伤反应中发挥关键功能作用。TMZ敏感细胞中EWSR1的核染色与急性TMZ处理和TMZ耐药细胞中的核和细胞质聚集形成显著对比。EWSR1蛋白的表达水平不随TMZ耐药增加而增加，与细胞核相比，细胞质部分中EWSR1的丰度增加。

作者试图通过低剂量放线菌素D（ActD）处理，为降低局部核仁RNA浓度并引起应激反应，测试替代（非TMZ）应激反应以及RNA在EWSR1聚集中的潜在作用；发现低剂量ActD处理导致EWSR1在核仁周围积聚，相反，EWSR1在42R和T98G细胞中的液滴之间形成连接结构。这进一步表明RNA缓冲在TMZ耐药细胞中EWSR1聚集中的作用。为确定EWSR1细胞质聚集体是否也存在于GBM临床标本中，作者对21个脑肿瘤样本（包括15个GBM）进行EWSR1染色。结果15例GBM样本中有9例EWSR1胞浆淀粉样聚集物阳性，而间变性星形细胞瘤或髓母细胞瘤均阴性。作者还观察到，在4个TMZ耐药复发性样本中，有三个样本的CLK2表达显著增加。总的来说，这些数据为未来的研究奠定基础，以确定EWSR1聚集和CLK2蛋白丰度在GBM中的异常剪接的功能作用。

研究结论

最后，作者指出, 该研究阐明TMZ耐药性GBM细胞中鸟嘌呤突变与DNA和RNA区域的易感变化的关系，以及这些变化影响RNA结合蛋白的功能和定位，上述发现可能是治疗TMZ耐药性胶质瘤的潜在靶点。

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