CRISPR-Cas9纳米胶囊穿透血脑屏障，参与GBM基因治疗

近期，河南大学的师冰洋等构建CRISPR-Cas9纳米胶囊，应用透射电镜和免疫荧光染色等方法，在体外GBM细胞培养、小鼠原位GBM模型和PDX模型中，明确其生物安全性、靶向性、高效性及显著的基因治疗效果，结果发表于2022年4月的《Science Advances》在线。

——摘自文章章节

【Ref: Zou Y, et al. Sci Adv. 2022 Apr 22;8(16):eabm8011. doi: 10.1126/sciadv.abm8011. Epub 2022 Apr 20.】

研究背景

胶质母细胞瘤（GBM）是恶性程度最高、预后最差的颅脑肿瘤。CRISPR-Cas9的基因编辑可以在细胞水平及体内快速、高效、精准完成。然而，其向脑部递送的生物安全性、靶向性及血脑屏障（BBB）渗透性等，是GBM治疗中的巨大挑战。近期，河南大学的师冰洋等构建CRISPR-Cas9纳米胶囊，应用透射电镜和免疫荧光染色等方法，在体外GBM细胞培养、小鼠原位GBM模型和PDX模型中，明确其生物安全性、靶向性、高效性及显著的基因治疗效果，结果发表于2022年4月的《Science Advances》在线。

研究方法

作者构建angiopep-2肽修饰的、二硫键交联聚合物包裹的CRISPR-Cas9纳米胶囊ANCSS（Cas9/sgRNA），免受核糖核酸酶的降解和增强血脑屏障的通透性。同时研究团队在监测其生物安全性的基础上，利用小鼠原位GBM模型和PDX模型，进一步验证其参与GBM基因治疗的效果。

研究结果

1. CRISPR-Cas9纳米胶囊的构建

作者构建具备靶向性和还原性的CRISPR-Cas9纳米胶囊——ANCSS（Cas9/sgRNA）。与物理性质相似的、非靶向性和非还原性的对照相比，该CRISPR-Cas9纳米胶囊具有更高的sgRNA保护能力与细胞摄取效率、更好的靶向性与特异性以及更高的血液稳定性。随后，作者选择有丝分裂关键基因（PLK1）作为模型基因，并发现该CRISPR-Cas9纳米胶囊有着更高的PLK1基因编辑效率，并由此诱导更高的凋亡比例（图1）。

图1. 构建CRISPR-Cas9纳米胶囊

2. CRISPR-Cas9纳米胶囊的脑部递送

在体外BBB的Transwell模型、3D-U87MG肿瘤球形模型和小鼠原位GBM模型中，作者明确该CRISPR-Cas9纳米胶囊的BBB、肿瘤渗透性和高效的基因编辑效率，较之游离Cas9/sgRNA消除半衰期更长。对小鼠原位GBM模型中的高风险组织进行免疫荧光染色，结果再次验证该CRISPR-Cas9纳米胶囊良好的BBB渗透性和脑肿瘤靶向性（图2）。

图2. CRISPR-Cas9纳米胶囊的脑部递送

3. CRISPR-Cas9纳米胶囊参与GBM基因治疗

在小鼠原位GBM模型和PDX模型中，该CRISPR-Cas9纳米胶囊抑制肿瘤生长，并显著延长小鼠的中位生存期。通过T7E1错配检测、Sanger测序及Western Blot等方法，明确该CRISPR-Cas9纳米胶囊通过提高基因插入缺失效率，进而破坏PLK1基因、降低GBM组织中PLK1的表达（图3-4）。此外，该CRISPR-Cas9纳米胶囊在高风险组织（肝、肾及正常脑组织）中脱靶效应不明显（潜在靶点突变频率低于0.5%），对小鼠肝肾功能、血常规等亦未产生不良影响（图5）。

图3. CRISPR-Cas9纳米胶囊在小鼠原位GBM模型中的基因治疗效果

图4. CRISPR-Cas9纳米胶囊在小鼠PDX模型中的基因治疗效果

图5. CRISPR-Cas9纳米胶囊的生物安全性分析

研究结论

综上所述，该研究构建的具备生物安全性的CRISPR-Cas9纳米胶囊能够有效透过BBB，将CRISPR-Cas9系统完整地、特异性地递送到GBM中，从而高效地发挥GBM基因治疗效果。其有望应用于GBM及其它脑肿瘤的基因治疗，具有极大的临床转化潜能。

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