m6A修饰关键调控蛋白YTHDF2影响胶质瘤胆固醇代谢

美国弗吉尼亚联邦大学梅西癌症中心分子医学研究所的Runping Fang等揭示YTHDF2加速LXRA mRNA的降解，从而促进GBM细胞中的胆固醇失调，影响胶质瘤的增殖侵袭；文章发表在2021年1月的《Nature Communications》在线。

——摘自文章章节

【Ref: Fang R, et al. Nat Commun. 2021 Jan 8;12(1):177. doi: 10.1038/s41467-020-20379-7.】

研究背景

胶质母细胞瘤（GBM）是成人常见的原发恶性脑肿瘤，发病机制尚未阐明。GBM的预后差，中位生存期仅14个月左右。EGFR是常见的扩增和突变基因，50%的GBM发生此突变。m⁶A甲基化修饰是真核生物mRNA常见的修饰方式，有研究显示m⁶A修饰阅读蛋白YTHDF2可以通过CCR4-NOT复合物的腺苷酸化或通过核糖核酸内切裂解使m⁶A标记的转录不稳定，进而影响肿瘤生长。胆固醇代谢失调是GBM甲基化修饰的另一个标志事件，受SREBPs和LXRs蛋白的调控。美国弗吉尼亚联邦大学梅西癌症中心分子医学研究所的Runping Fang等揭示YTHDF2加速LXRA mRNA的降解，从而促进GBM细胞中的胆固醇失调，影响胶质瘤的增殖侵袭；文章发表在2021年1月的《Nature Communications》在线。

研究方法

作者首先通过TCGA等多个胶质瘤数据库进行生信分析，发现m⁶A修饰关键酶YTHDF2在GBM中高表达。在胶质瘤细胞系（Hs683、SW1783）、GBM细胞系（T98G、U87 MG、U251 MG、LN229）和胶质瘤干细胞（GSC11、GSC17、GSC20、GSC23、GSC7-2、GSC6-27）进行Western blot检测，以及对人胶质瘤组织标本进行免疫组化（IHC）染色，结果都验证了YTHDF2在GBM中高表达，并和GBM患者预后不良明显相关。

为探究YTHDF2在胶质瘤中所起作用，研究者在3′端非翻译区（3′UTR）和编码区（CDS）运用shRNA敲除YTHDF2表达的稳转细胞系，即shYTHDF2#1和shYTHDF2#2，然后通过CCK-8实验、transwell实验以及BrdU掺入实验等，发现敲除YTHDF2后会明显抑制GBM细胞的增殖、侵袭和DNA复制。小鼠体内的实验结果显示，敲除YTHDF2表达能增加荷瘤小鼠的生存率。

接着，对胶质瘤细胞中YTHDF2的上调机制的研究中，作者分别对GBM中最常见的信号通路，如AKT、FGFR、PDGFRα/β、WNT、TGFβR1、EGFR、SRC和ERK1/2等信号通路分别进行抑制实验，结果表明EGFR/SRC/ERK信号通路对维持YTHDF2的表达很重要。野生型EGFR的激活或EGFRIII型变异（EGFRvIII）促进YTHDF2的表达，用Src抑制剂（SU6656）或ERK1/2抑制剂（SCH772984）处理GBM干细胞11（GSC11）可抑制基础水平和EGFR激活诱导的YTHDF2表达。

之后，研究者利用放线菌酮实验（CHX，测定YTHDF2的稳定性）、免疫共沉淀（Co-IP，研究YTHDF2蛋白相互作用法）、邻位连接实验（PLA，一种特殊的免疫分析法，可用于检测目标蛋白-蛋白相互作用）等技术，探索YTHDF2与其它蛋白的相互作用。结果表明，ERK1/2使丝氨酸39（S39）和苏氨酸381（T381）位点磷酸化以稳定YTHDF2。ERK1可直接使野生型YTHDF2磷酸化，而S39A和T381A突变削弱磷酸化效应，S39A/T381A双突变消除ERK1磷酸化效应。

研究者为确定YTHDF2的下游靶标，对GSC11细胞进行RNA免疫沉淀结合高通量测序（RIP-seq），接着通过甲基化RNA免疫共沉淀结合高通量测序（MeRIP-seq）找到可能与YTHDF2的下游靶标基因，然后参照已有的研究及发表的文献，将目标锁定到LXRA和HIVEP2。再通过紫外交联免疫沉淀（CLIP），确定LXRA、HIVEP2 mRNAs和YTHDF2蛋白间的作用。最后，通过胶质瘤患者的临床样本确认LXRA、HIVEP2和YTHDF2的表达趋势和相互作用。接着，作者首先在无YTHDF2表达的GSC11细胞单个敲除LXRA和HIVEP2，发现单敲可部分恢复胶质瘤细胞的增殖能力，而双敲能完全恢复细胞活力。LXRA和HIVEP2 mRNA可与GSC11和GSC7-2细胞中的YTHDF2蛋白相互作用，LXRA和HIVEP2是YTHDF2的直接靶点，敲除YTHDF2增加LXRA和HIVEP2 mRNA的表达。YTHDF2通过依赖于m⁶A的mRNA衰减下调LXRA和HIVEP2的表达。抑制EGFR、SRC和ERK则增加LXRA和HIVEP2 mRNA的表达。

目前已知LXRα是调控胆固醇的关键基因，研究者也从体外体内实验进行证实。首先，研究者敲除受LXRα调控的胆固醇代谢相关的基因（ABCA1、ABCG1和APOE），而YTHDF2的过表达降低这些基因的表达。然后，完全敲除YTHDF2降低胶质瘤细胞内胆固醇的水平，而胆固醇表达水平又可以通过敲除LXRα来挽救。补充胆固醇可以部分回补受到YTHDF2抑制的细胞活力。最后，作者进行裸鼠实验，验证上述结果在体内效果。通过GSC11和GSC7-2-颅内原位成瘤，发现敲除YTHDF2能明显抑制胶质瘤的形成，显著延长荷瘤小鼠的生存期。

结论

最后，作者认为上述发现拓宽EGFR下游的研究范围，揭示YTHDF2在GBM中的重要功能，并突出RNA m⁶A甲基化修饰在胆固醇代谢稳态中的重要作用。

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