2021年WHO新版中枢神经系统（CNS）肿瘤分类进一步强调分子检测在诊断中的核心作用，其中DNA甲基化分型已成为多种肿瘤亚型的关键判定标准。当前临床常用的Illumina EPIC等微阵列平台虽能提供可靠结果，但因设备昂贵且检测集中在少数大型中心，样本需跨地区运输并批量处理，往往使诊断周期延长至数天甚至数周。

纳米孔测序技术可在一次检测中同时获取DNA甲基化状态、拷贝数变异（CNV）和基因突变信息，具备实时、长读长和成本较低等优势，可在本地实验室快速开展，从而显著缩短报告时间。然而，现有纳米孔应用多采用低覆盖度策略，仅能实现甲基化分型，对单核苷酸变异（SNV）和结构变异（SV）的检测精度不足，仍需结合其他检测方法方能完成WHO整合诊断。

在此背景下，英国诺丁汉大学的研究团队开发了基于纳米孔测序的ROBIN（Rapid nanpOre Brain intraoperatIve classificatioN）系统，将中枢神经系统肿瘤的综合分子诊断时间由数周缩短至24小时以内，在50例前瞻性病例中与标准诊断一致率达90%。相关研究结果以“ROBIN：一种整合术中甲基化分型与次日全分子谱分析的统一纳米孔检测方法，用于超快速肿瘤诊断”（doi：10.1093/neuonc/noaf103）为题于2025年5月20日发表在《Neuro-Oncology》（IF：13.4/Q1）。

ROBIN系统基于Oxford Nanopore Technologies（ONT）PromethION高通量纳米孔测序平台，并结合自主开发的实时分析界面，可在本地实验室完成从样本处理到结果解读的全过程。手术中，神经外科医师采集肿瘤组织，经病理医生快速涂片评估后，挑选肿瘤细胞比例高、坏死少的样本进行DNA提取。DNA在室温条件下利用QIAmp Fast DNA Tissue Kit快速提取，随后采用改良转座酶建库方法，在约90分钟内完成文库制备，并保持较长的读长（平均N50约11.7 kb），为同时分析甲基化、拷贝数变异、基因突变和融合事件提供数据基础。制备完成的文库被加载到PromethION流动单元（R10.4.1）中，启动测序5分钟后便可产生数据并实时传入ROBIN系统。系统同步运行Sturgeon、CrossNN及随机森林三种甲基化分类器，并并行进行拷贝数变异、单核苷酸变异、结构变异以及MGMT启动子甲基化状态的分析。分析结果以可视化界面实时呈现，院内或远程的病理医师均可即时解读。通过该流程，术中2小时内即可获得高置信度的甲基化分型，24小时内即可完成涵盖多种分子标志物的综合诊断报告。

研究团队在30例回顾性病例及50例前瞻性术中病例中评估了ROBIN的性能。研究结果显示，在回顾性队列中，有24例（80%）在24小时测序后获得正确的甲基化分型；在前瞻性术中队列中，有45例（90%）与最终整合诊断一致。其中有38例（76%）在测序启动后1小时内，已有至少两种分类器达成一致判断，完成术中初步分型。常见误判来源包括分类器训练集中缺失的新实体及样本肿瘤DNA含量不足。

拷贝数变异（CNV）分析在PromethION高覆盖度支持下，与芯片数据高度一致，如胶质母细胞瘤的7号染色体扩增和10号染色体缺失、少突胶质细胞瘤的1p/19q共缺失等均被快速识别。单核苷酸变异（SNV）检测方面，ROBIN正确识别了全部已知的IDH1/2突变少突胶质细胞瘤和大部分星形细胞瘤，并检测到TERT启动子、TP53等典型突变。结构变异（SV）检测显示，该方法可在24小时内确认多种临床关键融合事件，并发现罕见复杂融合，如VGLL3::SAM13::CHD7。在前瞻性队列中，纳米孔测序获得的MGMT状态与芯片预测结果在46例中有44例（96%）一致，为化疗决策提供快速参考。与现行标准相比，该流程将甲基化分型平均诊断时间从33天缩短至2小时，将全分子诊断时间从68天缩短至24小时，且单样本成本约为400英镑。

研究通讯作者、英国诺丁汉大学Matt Loose教授表示：“2018年，我们首次完成整个人类基因组的测序，当时需要五个实验室协作、耗时长达六个月，这显然无法满足临床对时效性的迫切需求。如今，我们的新方法能够有针对性地选择并检测特定DNA片段，以回答关键问题，例如肿瘤的类型及其治疗策略。结合我们后续在快速检测人类基因组相关区域方面的研究成果，如今可以借助ROBIN在更短时间内完成对肿瘤的全面分类。一旦获得患者样本，我们便可迅速提取DNA，分析其中的多项关键信息。在这一流程中，我们最优先关注的是甲基化状态，因为它直接决定了肿瘤的分型。”

研究共同作者、英国诺丁汉大学医院Stuart Smith博士表示：“传统上，脑肿瘤的诊断过程往往既缓慢又昂贵。如今，借助这项新技术，我们能够在更短时间内为患者提供更多帮助，因为结果获取更为迅速，能对临床决策产生更直接、更显著的影响——最快可在两小时内完成。对于患者来说，等待数周出结果的过程极为煎熬，会在本已艰难的时期进一步加重焦虑与担忧。而这种手术本身可能耗时较长，因此外科医生有望在手术过程中便获得准确诊断，从而及时调整和优化手术策略。”

英国脑肿瘤慈善基金会首席科学官Simon Newman博士表示：“在手术后的数小时内就能提供准确诊断，这将为所有患者带来革命性改变，不仅能确保他们迅速获得最佳标准的治疗，更重要的是，能够消除患者在等待数周诊断和预后结果时所面临的不确定性。将众多独立检测整合为一次检测并在本地完成，这一能力是推动快速、准确分子诊断公平可及性的重大突破。由英国脑肿瘤慈善基金会资助的BRAIN MATRIX研究，正探索如何利用这项技术将患者与全英国范围内的个体化临床试验精准匹配。”