胶质瘤是常见的恶性脑肿瘤，其中胶质母细胞瘤（GBM）恶性程度最高，患者中位生存期不足15个月，现有治疗手段效果有限。肿瘤的高度异质性使得寻找有效靶点面临挑战。“合成致死”策略（即同时抑制两个非致死性靶点导致癌细胞死亡）为精准治疗提供了新方向。MTAP（5′-甲硫腺苷磷酸化酶）基因在约30%的胶质瘤中缺失。研究发现，在MTAP缺失的癌细胞中，PRMT5（蛋白质精氨酸甲基转移酶5）和MAT2A（甲硫氨酸腺苷转移酶2A）这两个参与甲基供体SAM代谢的酶，可能成为“合成致死”的靶点对。

研究团队综合利用了多种前沿技术：

1.生物信息学分析：利用TCGA数据库分析MTAP、PRMT5、MAT2A在胶质瘤中的表达及预后相关性。

2.细胞模型：使用多种胶质瘤细胞系（包括MTAP野生型和缺失型），通过CCK-8、克隆形成、EdU染色、流式细胞术（细胞周期/凋亡）、彗星实验（DNA损伤）、Western blot、免疫荧光等技术评估单药及联合用药对细胞增殖、周期、凋亡、DNA损伤及关键蛋白表达的影响。

3.3D类器官模型：利用患者来源的胶质母细胞瘤类器官（PDO），模拟体内肿瘤微环境，验证药物对复杂肿瘤结构的杀伤效果，并通过免疫组化分析标志物变化。

4.动物模型：建立小鼠原位胶质瘤模型，通过活体成像监测肿瘤生长，评估药物组合对肿瘤负荷和生存期的改善作用，并通过组织学分析（H&E、免疫组化）确认疗效机制。

5.机制探索：利用RNA测序（转录组分析）结合KEGG/GO通路富集分析，筛选联合用药后显著改变的信号通路，并通过Western blot和功能回复实验（使用AKT通路激活剂SC79）进行验证。

● TCGA数据分析显示，PRMT5和MAT2A在胶质瘤组织中高表达，MTAP表达与正常组织无显著差异。

● 关键预后因素：MTAP低表达的患者总生存期显著缩短，而PRMT5或MAT2A单独的表达水平与预后相关性不显著。

● MTAP、PRMT5、MAT2A三者的表达在数据库和组织芯片（TMA）分析中均呈现正相关。

● 细胞水平验证确认PRMT5和MAT2A在胶质瘤细胞系中普遍高表达，MTAP表达存在异质性，为后续筛选敏感细胞模型奠定了基础。

Figure 1: Lower MTAP expression predicts a worse prognosis. The target of the inhibitor is ubiquitously expressed in glioma and there is a co-growth correlation of expression

(A) Difference in RNA expression of MTAP, PRMT5, and MAT2A genes between tumor tissues and normal tissues in TCGA 2016 glioma database. (B) Difference in DAB staining, mean of MTAP, PRMT5, and MAT2A in tissue microarray (n=61). (C) Difference in overall survival time between the 2 groups with high and low MTAP expression. (D) Differences in overall survival among the 4 groups. Each group is categorized by high and low expression of PRMT5 and MAT2A. (E) Correlation scatter plot of MTAP, PRMT5, and MAT2A genes in TCGA 2016 glioma database. (F) Correlation scatter plot of DAB staining, mean values of MTAP, PRMT5, and MAT2A genes in tissue microarray (n=61). (G) Western blotting of MTAP, PRMT5, MAT2A, and SDMA in different glioma cell lines and the statistical analysis bar chart (n=3). (H, I, J) Immunofluorescence to determine the expression of MTAP, PRMT5, and MAT2A in 3 glioma cell lines and the statistical analysis bar chart (scale bar=100 μm) (n=3).

● CCK-8实验显示，PRMT5抑制剂单药在MTAP缺失（MTAP^-/-）的胶质瘤细胞系（如LN18, U87）中表现出更强的增殖抑制活性，而在MTAP野生型（MTAP^WT）细胞（如U251）中效果较弱。

● 在10种细胞系（5种MTAP^-/-，5种MTAP^WT）的大规模联合用药筛选中，SynergyFinder分析明确显示，MTAP^-/-细胞对PRMT5抑制剂（单药或联用）更敏感，且PRMT5i与MAT2Ai联用在MTAP^-/-细胞中表现出强烈的协同效应（正值），而在MTAP^WT细胞中协同效应较弱甚至出现拮抗（负值）。

● LC-MS证实，低浓度（10 nM）的MAT2A抑制剂即可显著降低细胞内SAM水平。

● Western blot显示，单药能抑制各自靶点活性，而联合用药在MTAP^-/-细胞中能更有效地耗竭对称性二甲基精氨酸（SDMA，PRMT5的主要催化产物）。

Figure 2: Inhibitors are more sensitive to homozygous MTAP-deleted glioma cells, and their combination can produce a stronger synergistic lethal effect

(A, B, C) CCK-8 assay to determine the viability of LN18, U87 and U251 cells after treatment with the PRMT5 inhibitor alone (10 nM), MAT2A inhibitor alone (10 nM), and with the inhibitor combination. (D) Mean IC50 values of the PRMT5 inhibitor for individual cell lines (n=3). (E) LC-MS analysis of SAM levels in LN18, U87, and U251 cell lines. (F) Western blotting to determine the change trend in PRMT5, MAT2A, and SDMA in LN18, U87 and U251 cells (PRMT5i: 10 nM; MAT2Ai: 10 nM), and the statistical analysis bar chart (n=3). (G, H) SynergyFinder 3.0 analysis for drug synergy with the PRMT5 inhibitor and MAT2A inhibitor in MTAP^-/- glioma cells and MTAP+/+ glioma cells. Positive scores (red) indicate synergism, and negative scores (green) indicate antagonism (n=3).

● 克隆形成实验显示，联合用药显著抑制了所有测试细胞系的集落形成能力，且在MTAP^-/-细胞中效果最为显著。

● 流式细胞术揭示，联合用药导致MTAP^-/-细胞（LN18, U87）阻滞在G2/M期，而MTAP^WT细胞（U251）不受影响。

● Western blot显示联合用药下调了G2/M期关键调控蛋白CDK1和Cyclin B1的表达。

● EdU荧光染色（检测DNA复制）进一步证实联合用药对MTAP^-/-细胞增殖的强力抑制。

Figure 3: The inhibitor combination can inhibit cell growth due to G2/M cell cycle arrest

(A, B) Cloning experiments in 10 cell lines after treatment with inhibitors (PRMT5i: 10 nM; MAT2Ai: 10 nM), and their statistical charts (n=3). One-way ANOVA for multi-group comparisons. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001. (C) Flow cytometry to determine the cell cycle in LN18, U87 and U251 cells after treatment with the inhibitors (PRMT5i: 10 nM; MAT2Ai: 10 nM), and their statistical charts (n=3). (D) Western blotting to determine changes in protein expression trends of CDK1 and cyclin B1 in LN18, U87 and U251 cells (PRMT5i: 10 nM; MAT2Ai: 10 nM), and their statistical charts (n=3). (E) Immunofluorescence assay to determine the effects of the 2 inhibitors (PRMT5i: 10 nM; MAT2Ai: 10 nM) in LN18, U87 and U251 cell lines using Edu staining (scale bar: 100 μm), and their statistical charts (n=3). One-way ANOVA for multi-group comparisons. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001.

● 形态学观察和彗星实验显示，联合用药导致MTAP^-/-细胞明显皱缩、产生大量碎片，并造成严重的DNA损伤。

● 流式细胞术（Annexin V/PI染色）证实，联合用药组早期和晚期凋亡细胞比例显著高于单药组和对照组。

● Western blot显示联合用药上调促凋亡蛋白BAX，下调抗凋亡蛋白BCL-2。

● TUNEL荧光染色（标记凋亡细胞DNA断裂）直接观察到联合用药组MTAP^-/-细胞中TUNEL阳性细胞数量激增。

● 同样，这些促凋亡和DNA损伤效应在U251（MTAP^WT）细胞中未观察到。

Figure 4: The inhibitor combination can cause apoptosis in cells via DNA damage

(A) Brightfield of LN18, U87 and U251 cell lines after treatment with the 2 inhibitors (PRMT5i: 10 nM; MAT2Ai: 10 nM) (scale bar: 100 μm). (B) Comet assay in LN18, U87 and U251 cell lines after treatment with the 2 inhibitors (PRMT5i: 10 nM; MAT2Ai: 10 nM) (scale bar: 100 μm). (C, D) Flow cytometry to determine the number of apoptotic cells in LN18, U87 and U251 cells after inhibitor treatment (PRMT5i: 10 nM; MAT2Ai: 10nM), and their statistical charts (n=3). One-way ANOVA for multi-group comparisons. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. (E) Western blotting to determine changes in protein expression trends of BAX and BCL-2 in LN18, U87 and U251 cells (PRMT5i: 10 nM; MAT2Ai: 10 nM), and their statistical charts (n=3). (F, G) Immunofluorescence assay to determine the effects of the 2 inhibitors (PRMT5i: 10 nM; MAT2Ai: 10 nM) in the LN18, U87 and U251 cell lines using TUNEL staining (scale bar: 100 μm), and their statistical charts (n=3).One-way ANOVA for multi-group comparisons. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001.

● 利用患者来源的胶质母细胞瘤类器官（MTAP^-/-：PDO-GYX；MTAP^WT：PDO-MHX）进行药物测试。

● 光镜下观察：联合用药对PDO-GYX（MTAP^-/-）类器官的破坏作用最强，表现为外周细胞大量脱落、结构崩解。单药PRMT5i也有效但弱于联合用药，MAT2Ai单药效果有限。PDO-MHX（MTAP^WT）类器官结构保持相对完整。

● 免疫组化分析：联合用药组PDO-GYX中，DNA损伤标志物γ-H2AX表达升高，增殖标志物Ki67表达降低，SDMA水平显著耗竭，并观察到细胞核固缩等凋亡形态。PDO-MHX中仅观察到SDMA耗竭，无明显损伤。

Figure 5: The combination of PRMT5 and MAT2A inhibitors produces synthetic lethal effects in glioma organoid models

(A) Immunofluorescence assay to determine MTAP expression in 2 glioblastoma organoids, and their statistical charts(n=3). (B) Flowchart of organoid experiments. (C, D) Brightfield images showing the cellular state of organoids after treatment with the inhibitors at 7 days and 14 days. (E, F) H&E staining and immunohistochemical staining of SDMA, Ki67, γ-H2AX using paraffin sections of glioblastoma organoids after 14 days of co-culture.

● 在荷U87（MTAP^-/-）细胞的小鼠原位胶质瘤模型中，与对照组和临床阶段PRMT5抑制剂AMG193组相比：

● PRMT5抑制剂单药组已显示出显著的肿瘤抑制效果。

● PRMT5i+ MAT2Ai联合治疗组效果最为突出，显著抑制肿瘤生长（活体成像显示荧光信号最低）并大幅延长小鼠生存期。

● 所有治疗组小鼠体重稳定，提示药物毒性较低。

● 脑组织切片H&E染色和免疫组化（Ki67, SDMA）证实联合治疗组肿瘤组织密度最低，增殖活性最弱，SDMA水平最低，与体外结果一致。

Figure 6: Inhibitors can significantly improve survival time and reduce tumor burden in nude mouse models in vivo 

(A) Flowchart of animal experiments. (B) Representative bioluminescence images of 4 groups of mice injected with cells (Vehicle, AM193 [100 mg/kg, PO, QD], PRMT5 inhibitor [100 mg/kg, PO, QD], combination of the PRMT5 inhibitor [100 mg/kg, PO, QD] and MAT2A inhibitor [5 mg/kg, PO, QD]). (C) Survival analysis of the 4 groups. (D) Bioluminescence analysis of the 4 groups. (E) Body weight analysis of the 4 groups. (F) H&E staining and immunohistochemical staining (Ki67, SDMA) of the brain sections of mice (scale bar: 100 μm)

● RNA测序结合KEGG通路富集分析表明，PI3K-AKT信号通路是联合用药后下调最显著的关键通路之一。

● Western blot进一步证实联合用药显著下调了PI3K-AKT通路关键蛋白（如p-AKT）的表达。

● 功能回复实验：添加AKT通路激活剂SC79，可部分逆转联合用药对MTAP^-/-细胞的增殖抑制和促凋亡作用，证实PI3K-AKT通路的下调是联合用药产生合成致死效应的关键机制。

Figure 7: Transcriptome sequencing suggesting inhibition of the PI3k/Akt pathway after treatment  

(A) Heatmaps indicating changes in gene expression in the 4 groups (NC, PRMT5i: 10 nM; MAT2Ai: 10 nM; combination: PRMT5i: 10 nM + MAT2Ai: 10 nM). (B) GO enrichment analysis for the 4 groups. (C) KEGG enrichment analysis for the 4 groups. (D) Western blotting to determine changes in protein expression trends of Akt, P-Akt, PI3k, and P-PI3k in these 3 cell lines (PRMT5i: 10 nM; MAT2Ai: 10 nM) and their statistical charts (n=3)

本研究系统性地证明了PRMT5和MAT2A抑制剂联合应用，在MTAP纯合缺失的胶质瘤模型中能产生强大的“合成致死”效应。这种效应通过诱导G2/M期阻滞、DNA损伤和细胞凋亡实现，其核心分子机制是抑制了关键的促生存信号通路——PI3K-AKT通路。研究在细胞系、3D类器官和活体动物模型三个层面均验证了联合治疗的有效性和选择性（针对MTAP缺失型）。特别值得关注的是：本研究使用的第二代PRMT5-MTA抑制剂显示出对MTAP缺失细胞的选择性，克服了第一代抑制剂（如GSK3326595, JNJ-64619178）疗效与MTAP状态无关且存在血液毒性担忧的局限性。与团队设计的MAT2A抑制剂联用，产生了更强的协同杀伤效果。研究为未来临床试验提供了重要的剂量、起效时间和疗效评估窗口期的参考依据（如体外需作用8天，类器官需14天）。

靶向PRMT5和MAT2A的联合抑制策略，为MTAP缺失型胶质瘤患者提供了一种极具前景的新型精准治疗方法。这种基于“合成致死”原理的治疗策略，有望克服胶质瘤的异质性挑战，改善这类难治性患者的预后。本研究为后续的临床转化奠定了坚实的理论基础和实验证据。

本研究由苏州大学附属第四医院神经外科黄煜伦教授团队主导完成，蒋作禹和李学涛为共同第一作者，相关抑制剂的合成及鉴定由勤浩医药（苏州）有限公司提供。研究得到了国家自然科学基金等多个项目的资助。