首先，使用OPTIClear对胶质瘤组织块（尺寸为5000μm×5000μm×500μm）进行透明化处理，组织透光性显著提升且无光线畸变，视觉上呈现透明状态，能够清晰辨识下方文字且无变形（图1a）。接着，使用CD31免疫标记、徕卡SP8共聚焦显微镜和Imaris软件，从不同空间视角成功展示胶质母细胞瘤血管网络的细致三维结构，包括血管分叉、血管排列及血管壁的窗孔结构（图1b）。总之，OPTIClear结合抗CD31免疫标记能够在完整胶质瘤组织中实现复杂血管网络的精确三维可视化。

图1.人脑胶质瘤血管三维可视化组织透明方法的验证

二维切片中，血管呈现管状、梭形及团簇状横截面形态，反映机械切片的局限性。虽然这些方法提供了细胞层面的信息，但无法捕捉复杂的三维血管结构。相比之下，同一患者的厚层手术切除样本经过组织透明化及三维成像，揭示了胶质瘤血管的完整空间组织（图1c）。

为比较两种成像方式揭示的血管异质性，他们对图1c中的血管进行了人工分割，Imaris建模（图2）及血管量化。三维图像显示，高级别胶质瘤（HGG）的血管分支更多，血管生成更为显著，而二维图像中未能明显体现这些差异。事实上，从二维图像计算的大多数血管指标可能存在失真。此外，全体积三维成像更清晰地显示HGG血管分布不均且形态更为不规则。因此，三维成像较二维成像更能揭示胶质瘤血管的异质性。

图2.二维和三维血管的分割和建模

为了探究三维视角下胶质瘤基底膜的形态，该团队使用IV型胶原（COL-IV）标记基底膜，发现HGG血管直径更大且形态异常，明显区别于非肿瘤组织和低级别胶质瘤（LGG）血管（图3）。

为深入探究血管壁特征，他们进行了内皮细胞（CD31）与基底膜（COL-IV）共染色，发现不连续的红色（CD31）和绿色（COL-IV）荧光信号呈现出血管壁的开窗状及血管腔塌陷结构（图3）。灰度值分析显示，相较于LGG，HGG中CD31与COL-IV荧光强度变化更不同步，反映出更广泛的微观血管壁破坏。

图3.血管基底膜标记可视化和基于共染色的血管壁分析

随后，为了更好地提取血管结构及形态特征，团队采用基于深度学习的算法对批量CD31染色的胶质瘤血管图像进行血管提取。3D U-Net及后处理步骤分别获得的平均Dice值为0.6773和0.6867，比较3D U-Net结果与真实标注可见，深度学习方法在提取血管方面达到接近人工标注的精度（图4）。

图4.基于深度学习算法的血管提取结果

此外，他们将深度学习分割方法与Imaris建模结果进行了对比。即使经过个性化阈值选择和手动调整，Imaris建模的血管仍未能完全覆盖荧光血管，而他们方法的掩膜几乎全部覆盖，显示深度学习方法远优于Imaris（图5）。

图5.Imaris和基于深度学习的三维血管提取方法的比较

因此，该深度学习算法能够有效处理图像中血管形态/尺度/破损及模糊程度不一、亮度/对比度及背景干扰多变的胶质瘤血管，在高通量和无偏的血管提取方面更为精准和自动化。

基于分割掩膜，该团队对非肿瘤脑组织、LGG及HGG血管形态进行了定量分析。经质量筛选后，分别来自2例非肿瘤脑、5例LGG及2例HGG样本的10、17及12个三维数据被纳入分析。

分析显示，不同胶质瘤级别间血管结构存在显著异质性。HGG血管直径显著大于LGG，血管分支点密度也更高。此外，HGG在血管体积比例、表面积比例及血管长度上均显著大于LGG（图6）。

将他们的量化结果和Imaris的量化结果进行比较发现，Imaris模型引入了主观偏见，且为识别细小血管容易高估血管直径。

图6.深度学习算法及Imaris在血管形态特征定量分析结果的比较

星形胶质细胞和胶质瘤细胞与血管密切相互作用，影响血管微环境。为了研究血管微环境中这些GFAP阳性细胞的异质性，他们采用相同方案及GFAP标记对肿瘤中的星形胶质细胞及胶质瘤细胞进行了可视化。

在非肿瘤及LGG组织中，GFAP阳性细胞呈有序的血管周围足端排列环绕血管。相较之下，HGG中类星形细胞（gemistocytes）呈细胞质肿胀状，数量增加，与血管壁呈不规则细胞质附着，符合胶质瘤细胞浸润，细胞增殖及代谢异常的特点。 Imaris分析也显示不同胶质瘤级别间GFAP表达的表面积比例存在显著差异（图7）。

值得注意的是，部分图像内细胞形态多样，可能反映肿瘤不同区域细胞形态的进展。此外，DAPI染色证实细胞数量随胶质瘤级别升高而增加（图7），与Ki-67指数相一致。

图7.人脑组织中血管周围星形胶质细胞和胶质瘤细胞的可视化和异质性分析

该团队利用OPTIClear组织透明化技术和基于3D U-Net的深度学习技术，实现人脑胶质瘤血管细胞分辨率的三维结构绘制，补充了传统组织病理学在捕捉完整组织三维空间异质性方面的不足。并且，他们提供了完整人脑胶质瘤标本血管三维重建及定性定量分析的实验方案。结合组织透明化和免疫染色技术的进步，以及未来对其他肿瘤微环境（TME）组分的应用，该方案将深化我们对人脑胶质瘤组织病理的理解。

在胶质瘤血管形态学分析领域，该团队创新性地结合组织透明化技术与深度学习方法，实现了厚层人体胶质瘤组织血管的深度三维可视化及精确形态学分析。并且，他们首次使用了端到端深度神经网络对透明化组织图像中的胶质瘤血管进行分割。另外，研究团队的血管三维绘制与分析揭示了胶质瘤的生物学机制，具备潜在临床价值。

与此同时，该研究属于初步探索，存在一些局限。首先，尽管显微镜物镜工作距离足够实现对整个透明化组织的物理对焦，有效免疫荧光成像深度仍受限于300μm。其次，尽管定量分析和观察到的结果与前人研究一致，仍需更多患者样本以进一步验证。第三，目前的工作重点验证组织透明化及深度学习在胶质瘤血管可视化中的方法学，其他TME组分的可视化及分析较为有限。未来工作将致力于将多重免疫标记技术与组织透明化结合，整合更多TME组分，绘制TME-血管互作图谱，实现人脑胶质瘤血管微环境生物学的空间分辨。

*拓展阅读：

撰文︱杨小渡 罗飞扬

审阅︱孙海涛