2024年10月18日发布 | 208阅读

【一起读文献】Nature Neuroscience:阿尔茨海默病新靶点:降低周细胞内钙浓度

刘颖璇

广东医科大学 广东省衰老相关心脑疾病重点实验室

梁春梅

广东省衰老相关心脑疾病重点实验室

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本文源自公众号:小崔和他的小伙伴们

导 读:

在阿尔茨海默病(AD)的早期,周细胞收缩毛细血管,增加其流体阻力和捕获免疫细胞,从而减少脑血流量(CBF)。目前缺乏减轻AD患者周细胞介导的收缩的治疗方法。最近《Nature Neuroscience》期刊上发表的题为“Inhibiting Ca2+ channels in Alzheimer’s disease model mice relaxes pericytes, improves cerebral blood flow and reduces immune cell stalling and hypoxia”的论文,作者在AD模型小鼠中发现整个毛细血管床的周细胞是免疫活性氧(ROS)诱发和周细胞细胞内钙浓度 ([Ca2+]i)介导的微血管流量减少的关键驱动因素。在疾病进展早期用尼莫地平阻断CaVs可改善CBF,减少周细胞体处的白细胞停滞,减轻脑缺氧。β淀粉样蛋白(Aβ)引起的人皮质组织周细胞收缩也被CaV阻断大大减少。因此,在AD早期降低周细胞[Ca2+]i可能提供一种治疗策略,以增强AD患者的大脑能量供应和可能的认知功能。

结果1.L型Ca2+和TMEM16A Cl -通道控制周细胞张力

周细胞收缩张力由Ca2+通过L型CaV和Ca2+门控Cl -通道TMEM16A之间的相互作用控制。我们减少阿尔茨海默病早期发生的CBF减少的策略是防止周细胞中的[Ca2+]i升高。图1b-g显示了CaV和TMEM16A阻滞剂如何实现这一目标。Gq蛋白偶联受体(GqPCR)激动剂,如ET-1 (a β-诱发AD周细胞收缩的驱动因子),从肌浆网释放Ca2+。这些Ca2+可能直接激活肌动球蛋白或通过TMEM16A通道触发Cl -退出,导致膜去极化和CaV活化,导致Ca2+内流和收缩。对具有表达tdTomato和钙指示剂GCaMP5g (NG2-CreERT2-GCaMP5g小鼠)的壁细胞的小鼠急性皮质切片进行双光子成像。ET-1增加周细胞[Ca2+]i和收缩毛细血管周细胞体(扩展数据图1b-d),其中大多数周细胞突起介导收缩(扩展数据图2a和补充视频1)。用尼莫地平阻断CaV,或用10bm阻断TMEM16A,极大地减弱了[Ca2+]i升高和周细胞收缩(扩展数据图1b-d),并且在SMCs中检测到尼莫地平引起的ET-1 [Ca2+]i升高的类似降低(扩展数据图1e),与CaV1.2(扩展数据图3)和TMEM16A在壁细胞中高表达一致。溶解尼莫地平的载体不调节周细胞中[Ca2+]i(扩展数据图1f)。我们的模型显示了TMEM16A和cav如何控制周细胞色调,如图1g所示。

结果2.体内CaVs在SMCs和周细胞中产生肌原性张力


我们对周细胞收缩的认识主要来自于脑切片实验。在体内,血管内压力和剪切应力释放内皮细胞的血管活性信使可能导致SMCs和周细胞收缩血管。为了评估CaVs是否在体内产生收缩性张力,我们使用激光多普勒血流仪测量CBF,并在体内对聚氨酯麻醉的NG2-dsRed小鼠的脑血管系统进行双光子成像,这些小鼠的周细胞和SMCs被dsRed标记(图1a,b)。FITC -葡聚糖(70kda,静脉(i.v))用于观察血流。股静脉输注可穿透血脑卒中的CaV阻滞剂尼莫地平(220 μg kg−1,超过10分钟,60 μg ml−1溶液)可使9只麻醉的成熟P120-P158野生型(WT)小鼠的CBF长期增加28%(图1b,c;“成熟”用于年龄为P110-P200的小鼠)。单独输注药组并没有改变CBF(图1c),这意味着尼莫地平提高了CBF,而不是给药组或少量血容量的增加。

腔内fitc -葡聚糖双光子成像(图1b)显示,尼莫地平诱发的脑血流升高与颅动脉、穿透性小动脉和第1 - 3支级毛细血管直径的持续增加相吻合(麻醉小鼠:图1d;未麻醉头部固定清醒小鼠:扩展数据图1h,i)。尼莫地平引起的毛细血管扩张在周细胞体细胞附近最大,并随着距离体细胞的距离而显著降低(图1e),这与周细胞介导尼莫地平引起的毛细血管扩张一致。

同时测量CBF和血压(BP)显示,尼莫地平静脉注射后7.5分钟,平均血压从88 mmHg降至67 mmHg(下降24%,P = 0.03,配对t检验;图1f),持续约30分钟。这与初始CBF的小幅下降有关,但随着自动调节机制将BP恢复到初始值,CBF上升到比尼莫地平前值高约25%。这些数据表明,尼莫地平引起的局部血管阻力的降低大于它引起的全身血压的降低(另一种CaV阻滞剂也报道了CBF增加的血压降低)。

由于Ca2+通过cav内流驱动周细胞收缩(扩展数据图1b-g),我们推测在尼莫地平引起的CBF增加之前,壁细胞[Ca2+]i减少。使用激光多普勒血流仪和NG2-CreERT2-GCaMP5g小鼠血管直径和壁细胞[Ca2+]i的双光子成像,我们证实尼莫地平诱发的[Ca2+]i下降(1 - 3级周细胞体细胞14%,1 - 3级周细胞过程32%,SMCs 22%)在CBF增加之前发生,并与血管舒张有关(图1g,h,j)。

周细胞胞体中[Ca2+]i达到峰值一半的平均时间(1.35±0.46 min)和CBF达到峰值一半的平均时间(8.41±1.42 min)差异有统计学意义(未配对t检验P = 0.004;图1i)。因此,SMCs和1 - 3阶周细胞中的CaVs赋予了WT小鼠的肌原性张力。

  图1 | CaVs在SMCs和WT小鼠体内的1-3级周细胞中产生张力。

结果3.CaVs增强毛细血管床周细胞的收缩


人AD早期CBF下降,与周细胞收缩毛细血管一致(因为,在小鼠AD模型中,毛细血管收缩,但小动脉和小静脉没有收缩)。因此,我们在NG2-dsRedxAPPNL-G-F AD小鼠模型中测试了CaVs是否有助于周细胞介导的毛细血管收缩,该AD具有瑞典、北极和伊比利亚的APP突变敲入以避免APP过表达的人工产物,并且具有标记为dsRed的壁细胞。因此,我们将APPNL-G-F小鼠称为AD小鼠。与其他AD模型的CBF减少一致,我们使用激光散斑成像(Methods)发现,与WT小鼠相比,P191-P206 AD小鼠的桶状皮质毛细血管灌注明显减少(图2a)。8只成熟P125-P158 AD小鼠体内1 - 3级毛细血管双光子成像显示,与年龄匹配的P120-P158 WT小鼠相比,周细胞体细胞毛细血管管腔变窄21% (P = 3.0 × 10−5,man - whitney检验;图2 b)。在其他AD小鼠模型中也可见类似的毛细血管收缩,这可能是由Aβ诱发的ROS和ET-1释放收缩周细胞驱动的。

尼莫地平静脉给药使成熟AD小鼠1 ~ 3级周细胞体毛细血管直径增加9.6%至6µm (P = 7.7 × 10−5,Wilcoxon检验),接近1 ~ 3级WT小鼠的6.9µm毛细血管直径(图2b), CBF(来自激光多普勒血流测量)增加51% (P = 0.0003;图2 c)。为了检验尼莫地平引起的血管舒张是否通过降低壁细胞[Ca2+]i而增加CBF,我们将激光多普勒血流法与双光子成像相结合应用于成熟ADxNG2-CreERT2-GCaMP5g小鼠。与WT小鼠一样(图1),在这些AD小鼠中,尼莫地平引起的壁细胞体细胞[Ca2+]i下降与毛细血管和小动脉直径增加以及CBF缓慢上升35%相关(图2):周细胞体细胞[Ca2+]i下降至峰值一半的平均时间(8.33±1.70分钟)和平均时间(16.7±1.45分钟)在36分钟达到峰值一半的CBF增加有显著差异(P = 0.007,未对t检验;图2 e)。尼莫地平显著降低了AD小鼠1 - 3阶周细胞过程中的平均[Ca2+]i(图2f和补充视频2),其覆盖毛细血管的程度与WT小鼠相似(扩展数据图2a)。

在图2d柱状图中同时记录的直径和血流时间过程数据中,尼莫地平对小动脉和毛细血管(周细胞)的外径(略低于管腔直径的变化)分别增加了17.8%和16.9%,血流增加了约40%。为了评估尼莫地平引起的毛细血管和小动脉直径的增加是否可以解释观察到的CBF增加,我们使用了先前的数学模型,其中小动脉的血管床阻力占43%(其中阻力与直径的四次方成反比),毛细血管的阻力占57%(其中阻力取决于周周周围直径的空间分布)。AD引起周细胞毛细血管直径减少21%(图2b),小动脉或小静脉直径没有变化,模型预测尼莫地平引起直径增加16.9%毛细血管(周细胞)和小动脉17.8%的增加(图2d)将使CBF增

加51%,与激光多普勒测量观察到的40-51%的增加相似(图2c,d)。我们得出结论,尼莫地平对CBF的影响可以通过引起血管直径的增加来解释,而不需要引起尼莫地平对周细胞和SMCs以外的细胞的影响。

图2|周细胞介导的毛细血管收缩和CBF减少涉及CaVs。

在第1 - 3支周细胞中,AD小鼠体细胞中的[Ca2+]i瞬态频率增加了3.7倍,过程中增加了2.6倍(图2g,h),而周细胞过程[Ca2+]i瞬态振幅(图2g)或SMC[Ca2+]i瞬态频率或振幅没有显著变化(图2i,j)。用尼莫地平治疗AD小鼠,可将周细胞过程中的1 - 3阶[Ca2+]i瞬态频率恢复到WT水平(图2g),并降低瞬态振幅(图2g,插图)。载体处理没有显著调节SMC或周细胞[Ca2+]i,也没有显著调节动脉、小动脉或毛细血管的直径(扩展数据图2d)。800 nm光的重复成像(GCaMP5G荧光缺乏Ca2+灵敏度)引起了恒定的荧光,没有可见的瞬态或光漂白衰减(扩展数据图2e-g和补充视频3),表明光漂白、运动伪影和制备损耗不影响测量的[Ca2+]i。尼莫地平因此降低波动以及平均[Ca2+]i在1 - 3阶周细胞。比较尼莫地平在19只成熟WT和11只成熟AD小鼠(P110-P191)中所有基因型(不考虑dsRed(图2c)或NG2-CreERT2-GCaMP5g(图2d)共表达)中诱发的CBF增加,AD小鼠的CBF增加(增加47%)比WT小鼠的CBF增加(增加27%)大74% (P = 0.03,采用Welch校正的非配对t检验;扩展数据图2c),这意味着AD小鼠中CaVs诱发的张力更大(正如预期的那样,AD中发生的周细胞介导的毛细血管收缩以及CaVs对周细胞张力的产生的贡献)。因此,阻断AD中的CaVs,例如使用尼莫地平,是逆转AD早期发生的CBF减少的潜在途径(图2k)。

虽然1 - 3级毛细血管上的收缩周细胞(如上所述)可以快速调节毛细血管直径,但我们发现毛细血管床中部和小静脉侧的毛细血管(以下称为“>3级”)占WT小鼠毛细血管总长度的91%,AD小鼠占94%(扩展数据图4a)。由于>3阶周细胞可能在缓慢的时间尺度上产生收缩张力,并占据大部分毛细血管床(大部分脑血管阻力所在),因此它们可能对尼莫地平反应的CBF产生强烈影响。然而,在体内测量WT小鼠周细胞体细胞>3级毛细血管直径时,尼莫地平给药后毛细血管直径没有明显变化(图3a,b)。尼莫地平对WT小鼠小静脉直径也无显著影响(增加12.2%,配对t检验,t = 40 min,配对t检验,P = 0.06, n = 7)。相比之下,在AD小鼠中,与WT小鼠相比,周细胞体细胞的>3级毛细血管明显收缩(13.5%),尼莫地平静脉注射治疗部分逆转了这种收缩(图3b),这与尼莫地平降低>3级周细胞体细胞和过程中的[Ca2+]i一致(图3c)。值得注意的是,即使是与WT小鼠相比,AD >3阶周细胞体中的[Ca2+]i瞬态频率升高,但尼莫地平并未调节>3阶周细胞体或过程中的[Ca2+]i瞬态频率,但确实降低了瞬态振幅(扩展数据图2h)。>3阶周细胞调节毛细血管直径以响应缺血损伤的能力一直存在争议。为了测试>3阶周细胞是否可以收缩(如可能发生在缺血和AD皮层,血管收缩剂,如ROS水平升高),我们诱导双光子激光实质性损伤产生ROS,在激光束瞄准NG2-CreERT2-GCaMP5g WT小鼠皮质单毛细血管约15-20µm(图3d)。我们在3级或更高阶周细胞中检测到强烈的[Ca2+]i升高,这与周细胞体细胞的毛细血管收缩相吻合,但在距离这些体细胞≥20 μm的毛细血管管腔部分收缩明显较小(图3e-g,扩展数据图4b和补充视频4)。激光引起的周细胞收缩也强烈增强了血液的停滞,在染料填充的血浆中表现为阴影(图3h)。令人惊讶的是,在1 - 2级毛细血管或小动脉附近,相同的激光诱发损伤不会调节周细胞或SMCs中的血管直径或[Ca2+]i(扩展数据图4b-d和补充视频5)。尽管壁细胞对局部激光损伤的反应沿血管树而异,但这些数据证实,>3阶周细胞可以产生毛细血管收缩。

图3|AD小鼠毛细血管中床周细胞可增强收缩张力

结果4.免疫细胞ROS升高AD小鼠[Ca2+]i,降低CBF

上述数据表明,在体内,周细胞CaVs介导AD皮层毛细血管床的毛细血管收缩,但其收缩机制尚不清楚。当将Aβ低聚物急性应用于WT脑切片时,产生ROS, ROS释放ET-1,从而通过激活CaVs通道引起收缩。同样,氧化应激发生在人类AD中,并在AD模型中损害CBF。在NG2-CreERT2-GCaMP5g小鼠中进行体内双光子成像(图4a),我们发现,通过向暴露的桶状皮质局部施加1 mM H2O2产生氧化应激,使周细胞[Ca2+]i增加2.07倍(图4a),与ROS引起周细胞收缩的报道一致。H2O2诱发的[Ca2+]i升高随着皮质深度的增加而降低(图4a,插图),表明H2O2的扩散仅限于皮质上层。对于皮质深度匹配的周细胞,尼莫地平(220 μg kg - 1 i.v)将H2O2引起的[Ca2+]i升高降低了54%至1.49倍(图4a),因此CaVs介导了体内至少一半的[Ca2+]i升高。尼莫地平也大大降低了H2O2在SMCs中引起的[Ca2+]i升高(图4b)。

图4| 来自脑免疫细胞的 ROS驱动AD小鼠的周细胞收缩

急性应用Aβ引起的周细胞收缩部分依赖于小胶质细胞和血管周围巨噬细胞(PVM)通过NOX2产生ROS,在大脑中,包括人类AD,在小胶质细胞和PVM中表达(扩展数据图5a和6g)。小胶质细胞和PVM的贡献可能随毛细血管床位置的不同而不同,因为PVM在小动脉周围和毛细血管床的前几个分支中数量更多(扩展数据图6c,d)。

图5 | CaV抑制减少了AD中由血细胞引起的周细胞诱发的毛细血管阻滞

为了测试Aβ在AD中的积累是否同样在小胶质细胞中产生ROS,我们用ROS传感器二氢乙啶(DHE)孵育WT和AD小鼠的急性皮质切片,当氧化的DHE插入DNA时,DHE发出荧光。在隔离素b4标记的小胶质细胞/ PVM中,与WT小鼠相比,AD小鼠的DHE荧光(在没有DHE的情况下归一化为自身荧光)增加了49%(图4c,d),尽管AD小鼠的自身荧光更高。同样,在单核细胞下表达增强的绿色荧光蛋白(eGFP)的ADxNG2-dsRed小鼠皮质切片中,使用ROS传感器CellROX证实了AD小胶质细胞/ PVM产生ROS谱系启动子Iba1(扩展数据图5k;见下文)。相比之下,周细胞、其他血管细胞(不是ib4标记的周细胞)或除小胶质细胞/PVM(定义为IB4阴性细胞IB4标记的皮质切片的血管外空间呈阴影)外的血管外细胞均未检测到DHE荧光的变化;扩展数据图5b)。此外,使用MitoSOX在小胶质细胞或周细胞中测量的线粒体ROS在WT小鼠和AD小鼠之间没有差异(扩展数据图5c)。

ROS水平的升高可能通过触发Ca2+进入壁细胞cav而导致AD的CBF下降(图4a,b),因此我们测试了是否可以通过NOX2阻断小胶质/PVM产生ROS来调节AD小鼠的CBF。在体内将NOX2阻滞剂GSK2795039 (GSK)局部应用于AD小鼠皮质表面使CBF增加42%(与载药治疗相比;图4 e)。在AD小鼠模型中,其他NOX2阻滞剂也有类似的改善毛细血管流动的报道。为了更好地模拟临床场景,我们因此测试了临床批准的ROS清除剂,血脑屏障渗透性抗氧化剂N -乙酰半胱氨酸(NAC)如何调节AD小鼠的CBF。NAC (50 mg kg - 1 i.v)使CBF增加62%(图4f),降低周细胞体细胞和SMCs中的[Ca2+]i(图4g),这与NAC减少ROS引起的壁细胞[Ca2+]i升高并阻断其收缩一致。相比之下,抗氧化剂谷胱甘肽(150 mg kg - 1 i.v)与NAC不同,它不能很好地穿过BBB(因此主要清除外周活性氧),不能调节CBF(扩展数据图5d)。

由于Aβ斑块是Aβ寡聚物和ROS的储存库,在小胶质细胞中驱动不同的炎症谱,我们研究了距离(<65 μm)和距离(>65 μm) Aβ斑块的小胶质细胞中ROS的产生是否不同,以及ROS是否可以被NAC靶向。使用ROS传感器CellROX,我们测量了ADxNG2-dsRedxIba1-eGFP小鼠皮质切片中的ROS。在(1)斑块处表达Iba1的小胶质细胞、(2)远离斑块处表达Iba1的小胶质细胞和(3)与周细胞和少突胶质前细胞(OPC)标记物NG2共同表达Iba1和P2Y12受体(P2Y12Rs)(通常用作小胶质标记)的斑块相关小胶质细胞中测量ROS(扩展数据图5e-h)。这第三类细胞先前在面神经轴切、缺血、帕金森病和阿尔茨海默病中被发现,转录组学表征显示这些细胞具有高度增殖性。表达NG2的小胶质细胞主要存在于斑块中(扩展数据图5f,i),在AD皮层中随着年龄的增长而增加(斑块负担随着年龄的增长而加重),但在WT小鼠大脑中不存在,只出现在AD小脑中(扩展数据图5j),其中Aβ沉积在AD中很晚才出现,CBF没有变化。添加CellROX可使皮层中位于斑块处的Iba1标记的小胶质细胞的633 nm波长荧光(在没有CellROX的情况下为自身荧光)增加57%,在远离斑块处的Iba1标记的小胶质细胞中增加45%,在表达NG2的小胶质细胞中增加33%(扩展数据图5k)。

图6|尼莫地平改善AD小鼠的CBF,减少脑缺氧,减少Aβ诱发的人脑组织周细胞收缩

50µM NAC预孵育可显著降低cellrox诱发的荧光在斑块处和远离斑块的小胶质细胞处分别增加16%和18%;但没有显著降低表达NG2的小胶质细胞中的CellROX荧光(扩展数据图5k)。因此,在AD小鼠中,活性氧的产生在很大程度上被NAC阻断。

与AD和脑炎症期间小胶质细胞向血管迁移一致,我们发现,与WT小鼠相比,体内桶状皮质和灌注固定的ADxNG2-dsRedxIba-eGFP小鼠皮质中Iba1标记的小胶质细胞/PVM体细胞和周细胞体细胞之间的距离减少(图4小时和扩展数据图6a,b)。这在1 - 3和>3支级毛细血管的周细胞中都是如此(扩展数据图6b):因此,在AD小鼠的毛细血管床中,小胶质细胞/PVM体细胞更接近周细胞体细胞。每个毛细血管长度的周细胞密度(扩展数据图2b),小胶质细胞密度(图4i), PVM密度(固定WT和AD皮质1 - 4级毛细血管每个毛细血管段的PVM数,P = 0.9, Mann-Whitney检验;图6c,d)和脑萎缩(见下文)在4 - 6月龄的WT和AD小鼠中是相同的,排除了这些参数的变化导致AD中周细胞更接近小胶质细胞。有趣的是,据报道,阿尔茨海默氏症患者额上回距离周细胞小于10 μm的小胶质细胞比例减少了,但在我们的小鼠中,阿尔茨海默氏症患者距离周细胞10 μm内的小胶质细胞比例增加了(扩展数据图6a)。在人类研究中,只有大约4%的小胶质细胞距离周细胞小于10 μm ,因此周细胞与小胶质细胞的平均距离将由96%的非周细胞相关的小胶质细胞主导。这些差异与人类论文的原因尚不确定,但它们可能反映了人类患有更严重的AD(比我们的小鼠),这与周细胞丢失有关(与我们的研究不同:扩展数据图2b),或者是研究了不同的大脑区域。我们发现,与WT小鼠相比,ADxNG2-dsRed小鼠中p2y12r标记的小胶质细胞体细胞或CD-206标记的PVM体细胞与1- 3支阶周细胞体细胞之间的距离分别减少了27%和67%(扩展数据图6f),这与AD中表达iba1的细胞与周细胞之间的相互作用增强(图4h)一致。

WT和ADxIba1-eGFP小鼠的桶状皮质体内成像显示,与WT小鼠相比,AD小鼠的小胶质细胞累积像素监测(超过20分钟)大大减少(图4j,k)。然而,在AD小鼠中,细胞大小无关的运动性(每个细胞按其面积划分的监测指数)没有变化(图41),这表明监测减少反映了AD小鼠中的小胶质细胞分支比WT小鼠少(图4j)。因此,尽管监测减少可能会减少AD小鼠中小胶质细胞过程与毛细血管的相互作用,但与WT小鼠相比,AD小鼠的小胶质细胞/PVM体更靠近血管,这可能缩短了释放的ROS需要扩散以调节血管张力的距离。图4m总结了AD中受损的血管-免疫细胞相互作用如何引起周细胞收缩。

结果5.AD小鼠小静脉端周细胞驱动白细胞迟滞


为了测试周细胞诱发的阿尔茨海默病毛细血管管腔狭窄(图2b、d和3b、c)是否会导致血流在周细胞体附近(收缩最大的地方)受阻,我们获得了三维体内双光子成像堆栈,捕获每个毛细血管段约3-5秒(约3-5帧,取决于毛细血管方向)。如前所示,我们发现毛细血管阻塞的百分比在WT老鼠从0.47%上升到5.2%AD老鼠(图5和补充视频6)。如果在毛细血管块被随机放置,那么斑块发生的概率应该恒定的,距离应为周细胞间距离的一半,即(对于每144µm的一个周细胞:扩展数据图2b)为72µm(在更大的距离上,块将沿着毛细血管靠近下一个周细胞)。测量毛细血管中119个阻滞点到最近周细胞体细胞的距离,发现随机阻滞位置(在72µm处达到统一的直线)的累积概率分布与实验观察到的有显著差异;随机定位的毛细血管块与周细胞之间的距离比预期的要近(图5b;P = 3.1 × 10−12,Kolmogorov-Smirnov检验)。

PAs对AD小鼠毛细血管分支顺序的追踪显示, PAs对1 - 2级毛细血管无阻滞,对3级毛细血管有13%阻滞,对≥4级毛细血管有87%阻滞。追踪上升小静脉(AVs)的分支顺序,87%的阻滞发生在AVs的1 - 3级毛细血管分支(图5c)。因此毛细血管阻塞主要发生在毛细血管床的小静脉端,那里的毛细血管直径最小(在AD中进一步减小;图3 b)。

由于循环单核细胞和中性粒细胞被募集到AD大脑,并且比红细胞更小、更大,我们通过使用ADxIba1-eGFP小鼠对单核细胞进行成像,并使用低剂量的Ly6G荧光偶联抗体(0.1 mg kg - 1 i.v,不诱导中性粒细胞)对中性粒细胞进行成像,探索了它们对毛细血管停滞的贡献。在三维成像堆栈中(如图5a),我们发现1.7%的毛细血管显示含有中性粒细胞的斑块,0.9%的毛细血管显示含有单核细胞的斑块(图5d)。我们没有同时标记中性粒细胞和单核细胞(因此含有中性粒细胞的斑块也可能含有单核细胞),但是,它们可能占5.2%毛细血管斑块的一半(图5a),其余斑块可能含有红细胞(见下文)。由于白细胞的失速持续时间决定了失速引起的CBF减少的程度,我们通过在单个平面上以2hz的频率对毛细血管进行成像来捕捉失速的发生和偏移(补充视频7)。中性粒细胞的平均失速持续时间比单核细胞长5.4倍(图5e),可能是因为它们更不灵活或更多地粘附在内皮细胞上(一些单核细胞也短暂地粘附在枢轴静脉或动脉上,而不阻止血液流动(图5d)。右下角图片和补充视频8)。

与周细胞诱发的毛细血管狭窄驱动白细胞失速一致,我们发现中性粒细胞失速部位的毛细血管直径明显小于中性粒细胞的直径,导致中性粒细胞向毛细血管壁推进(图5f和补充视频9),可能增强了它们与内皮细胞上的ICAM-1和VCAM-1粘附分子的相互作用(扩展数据图7a-f)。事实上,低剂量的抗Ly6G,它连接Ly6G降低中性粒细胞表面整合素的表达,从而降低整合素与ICAM-1的结合(不诱导中性粒细胞死亡),增加了AD小鼠的CBF,但在WT小鼠中没有(扩展数据图7j,k)。与中性粒细胞不同,失速单核细胞的直径不大于它们失速的毛细血管段的直径(图5)。如果周细胞引起的毛细血管收缩导致白细胞迟滞,那么使用尼莫地平增加毛细血管直径可以缓解毛细血管阻塞。我们使用FITC -白蛋白灌注方案来测试这一点,以显示固定皮质切片中所有在体内已通畅的血管,以及有助于阻塞非通畅毛细血管的粘附细胞(方法)。在载药处理的AD小鼠中,与WT小鼠相比,我们检测到Aβ斑块附近(但没有远离)的毛细血管存在明显的灌注缺陷(图5h,i)。此外,与WT小鼠相比,AD小鼠的皮质毛细血管中含有更多被阻断的白细胞(CD45标记)、中性粒细胞(Ly6G)和红细胞(ter119)(图5h,j,k)。值得注意的是,在AD小脑(大部分缺乏Aβ沉积)中,毛细血管灌注和中性粒细胞阻滞不受影响(扩展数据图7i)。阿尔茨海默病患者皮层毛细血管中白细胞的增加并不反映血液白细胞计数的增加(扩展数据图7g和补充图1)。此外,与相关中性粒细胞相关的阻滞发生在周细胞体细胞附近(扩展数据图7h),表明阻滞是由周细胞收缩毛细血管驱动的。事实上,我们发现,在体内用尼莫地平治疗1.5小时的AD小鼠,毛细血管灌注得到了很大程度的恢复,停滞的白细胞和红细胞数量减少到低于WT计数(图5i-k)。因此,尼莫地平通过几种方式增加AD患者的CBF:通过逆转发生的毛细血管直径的减小(从而也维持血管的血流)血液粘度降低,并减少随后由白细胞和红细胞造成的毛细血管阻塞。

结果6.尼莫地平改善AD小鼠脑血流,减少脑缺氧


在确定了尼莫地平如何逆转阿尔茨海默病小鼠CBF的减少后,为了模拟早期阿尔茨海默病治疗的临床场景(假设早期阿尔茨海默病诊断),我们在饮用水中使用尼莫地平或代药治疗阿尔茨海默病小鼠1.5个月(图6a和扩展数据图8a,b),从年龄(2-3个月)开始,标志着突触丧失和A β斑块沉积的开始,但早在记忆丧失之前。通过体内双光子成像,我们发现尼莫地平治疗显著增加了整个皮质血管的毛细血管直径(图6b),并大大减少了小动脉>3支级毛细血管的血液阻塞(图6c和补充视频10)。给药组和尼莫地平组小鼠的1 - 3阶毛细血管中基本没有隔间(图5c和6c)。为了测试尼莫地平是否也能调节皮质下区域的CBF(双光子显微镜、激光多普勒血流仪或激光散斑成像无法获得),我们使用动脉自旋标记(ASL) MRI非侵入性测量丘脑的CBF。这表明长期尼莫地平治疗显著增加AD小鼠丘脑CBF(图6d)。

用吡莫硝唑在体内测量脑缺氧情况显示,AD增加了Aβ斑块附近皮层和海马中的缺氧细胞数量,并且在尼莫地平治疗1.5个月后,缺氧细胞数量大大减少(图6e,f)。尼莫地平还显著减少了溶酶体相关膜蛋白1 (LAMP1)标记的斑块相关溶酶体(在小胶质细胞和轴突肿胀中)的数量(图6g)。这些尼莫地平引起的变化不太可能被脑萎缩的变化所偏倚,因为在药物治疗和尼莫地平治疗的小鼠中,皮质和海马区域是相似的(来自活体MRI;扩展数据图8c)。

尼莫地平治疗1.5个月没有调节毛细血管、小动脉或小静脉中内皮细胞ICAM-1或VCAM-1的表达(扩展数据图7a-f),也没有调节3只药物治疗和4只尼莫地平治疗的成熟AD小鼠的FITC -葡聚糖外渗(来自Mann-Whitney试验的P = 0.6和P = 0.8,分别测量皮质表面深度<40µm和40 - 126µm处的外渗)。与WT小鼠相比,未经治疗的AD小鼠的FITC -葡聚糖外渗和纤维蛋白原沉积增强(扩展数据图9a-e)。对于FITC -葡聚糖,在最靠近皮质表面的40 μm区域外渗最大(扩展数据图9b,c)。在皮质表面以下超过40 μm的深度,AD显著增加了成熟和老年小鼠的外渗(扩展数据图9c),而在深度小于40 μm的深度,AD增加了老年小鼠而非成熟小鼠的外渗(扩展数据图9b)。AD患者纤维蛋白原沉积在淀粉样斑块附近最多(扩展数据图9d,e)。治疗1.5个月后,载药组和尼莫地平组在饮水量、体重、呼吸频率或Aβ斑块负荷方面均无差异(扩展数据图8a-d)。在另一组阿尔茨海默病小鼠中,我们在饮用水中加入对照剂或尼莫地平治疗10-11天,我们检测到毛细血管直径的类似增加和毛细血管阻塞的减少(扩展数据图8e-g),这表明尼莫地平在1.5个月的治疗过程中早期恢复了CBF,并且这种改善至少持续了尼莫地平治疗1.5个月(图6b)。

由于老年AD脑CBF下降,我们试图研究急性尼莫地平治疗对老年WT和AD小鼠CBF的影响。通过激光多普勒血流测量,我们发现老年(>P200) AD小鼠与成熟(P110-P200) AD小鼠相比,尼莫地平诱发的CBF增加明显减弱(63%,P = 0.03)(扩展数据图10a)。尽管在WT中,尼莫地平诱发的CBF升高与衰老成正相关,但在AD中,尼莫地平诱发的CBF升高与衰老和可能的皮质Aβ呈负相关斑块负荷(扩展数据图10b-d)。尽管在老年AD小鼠中,尼莫地平引起动脉、小动脉和1 - 3级毛细血管扩张,但尼莫地平引起的>3级毛细血管扩张在治疗后1小时内基本消失(扩展数据图10e)。在阿尔茨海默病晚期,这与(1)周细胞加速丢失(扩展数据图10f)一起,这将导致血脑屏障分解(部分是由于白细胞粘附分子的上调),(2)壁细胞CaVs的下调(扩展数据图3e)和(3)突触和神经元的损失表明,壁细胞[Ca2+]i降低药物可能为阿尔茨海默病的预防或早期治疗提供最大的好处。

结果7.尼莫地平逆转Aβ诱发的人皮质组织周细胞收缩


为了测试CaVs是否有助于人类Aβ诱发的周细胞收缩,我们在没有或存在尼莫地平的情况下,将活的人类皮质组织与人工脑脊液(aCSF)单独或与可溶性Aβ低聚物孵育(图6h)。单独在aCSF中,与远离周细胞体相比,靠近周细胞体的外毛细血管直径明显扩大(P = 0.0003, Mann-Whitney t检验;图6i)如先前报道的,可能反映了周细胞体细胞释放诱导内皮管生长的因子。应用Aβ低聚物可显著收缩周细胞体细胞附近的毛细血管(P = 10−7,采用Tukey事后检验的单因素方差分析),但在周细胞体细胞附近没有引起显著的直径减小(P = 0.08,采用Kruskal-Wallis检验和Dunn事后检验)(图6i)。然而,当在尼莫地平持续存在的情况下应用Aβ低聚物时,周细胞体细胞的毛细血管直径与载体处理的毛细血管直径没有显著差异(P = 0.5, Kruskal-Wallis检验和Dunn’s post - hoc检验)(图6i)。因此,在活的人脑组织中,A β诱发的周细胞收缩是由l型CaVs的激活驱动的,可能是在人周细胞中表达的CaV1.2亚型(扩展数据图3)。因此,在AD患者中,尼莫地平应该增加毛细血管直径并减少缺氧,就像在小鼠中一样。

小 结



作者团队针对AD中周细胞引起毛细血管收缩的几种机制:使用血脑屏障阻断剂尼莫地平通过l型钙通道进入Ca2+;Ca2+门控Cl -通道TMEM16A使用阻滞剂10bm使[Ca2+]i扩增 ;以及使用抗氧化剂(NAC和GSK)时ROS对周细胞收缩的贡献。这些药物减少周细胞介导的毛细血管收缩(图2-4和扩展数据图1)并增加CBF。尼莫地平使周细胞松弛不仅通过降低血管阻力直接增加脑血流;它还减少了被困在周细胞附近的白细胞和红细胞的数量,并使毛细血管血流停滞(图5i-k)。因此,尼莫地平可以消除AD脑中的缺氧(图6e,f)。因此,靶向CaVs、TMEM16A或ROS可能有助于治疗开发,以维持脑血流并改善AD期间的神经元功能


精彩文献下载:

Korte N, Barkaway A, Wells J, Freitas F, Sethi H, Andrews SP, Skidmore J, Stevens B, Attwell D. Inhibiting Ca2+ channels in Alzheimer's disease model mice relaxes pericytes, improves cerebral blood flow and reduces immune cell stalling and hypoxia. Nat Neurosci. 2024 Sep 18. doi: 10.1038/s41593-024-01753-w. 



编 译:刘颖璇

校 审:梁春梅


END

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