由于人们对驱动人类神经元衰老的内在病理生理事件了解不完全以及对药物的作用机制了解有限，AD一直是一种具有挑战性的疾病。近期，《Alzheimers & Dementia》期刊上发表了题为“A functional aged human iPSC-cortical neuron model recapitulates Alzheimer’s disease, senescence, and the response to therapeutics”的论文。之前，作者团队开发了一种方法，利用在定制微电极微阵列(MEAs)上培养的人类iPSC衍生的皮质神经元作为一种无创方法，在癫痫和AD模型中测量神经元长期增强(LTP)，以此表明神经元学习和记忆的形成。在本篇文章中，作者通过识别衰老生物标志物来纵向追踪细胞衰老，并将这些标志物与人类神经元LTP功能对淀粉样蛋白-β (Aβ)低聚物和治疗性化合物的响应进行实时关联。结果表明，Aβ42可诱导突触损伤和凋亡神经元簇的异常形成。此外，Aβ42诱导内源性tau蛋白Ser202/Thr205位点磷酸化，进而促进了致病性tau聚合和纤维的形成。另外，通过纵向监测神经元的衰老，该模型还揭示了Aβ42是神经元衰老的驱动因素，导致线粒体电位受损，并加剧了活性氧(ROS)的产生。

超过90%的阿尔茨海默病病例源于病因不明的零星事件，其中淀粉样蛋白假说将Aβ的积累或清除减少置于神经退行性变的中心阶段，最终导致痴呆。然而，目前尚不清楚是哪些细胞和病理生理事件引发了散发性AD。为了在这种无血清和明确的衰老模型中建立一种模拟散发性AD发病的方案，作者首先用5µM Aβ42低聚物处理体外培养40天的hiPSC来源的皮质神经元，以诱导致病信号通路的激活。1小时后，再加入5µM Aβ42以保持恒定浓度的基础上，以5µM美金刚处理神经元作为治疗干预模式。作为对照，平行培养物用5µM非致病性Aβ-扰乱(Aβscrb)处理。作为起点，体外治疗延长至72小时。

突触小泡蛋白是存在于突触囊泡中的一种完整的膜糖蛋白，突触囊泡沿轴突逆行和顺行运输物质。通过捕获突触体素-囊泡沿轴突网络的运输，突触体素可作为影响中枢神经系统的疾病中轴突损伤的可靠读数。因此，分别用Aβ42和Aβ42加美金刚急性处理的神经元进行突触素表达染色。共聚焦显微镜显示，Aβscrb处理的神经元显示出健康培养的轴突网络(图1A)。相比之下，用Aβ42低聚物处理的细胞显示轴突中断和体细胞异常聚集(图1B)。类似的表型先前已被表征，其中致病性Aβ优先聚集在细胞膜突起上，诱导异常起泡和细胞死亡。用美金刚加突触毒性Aβ42共同处理的神经元显示出突触的恢复和体细胞异常聚类的减少，更接近于对照条件的表型(图1C)。

与Aβscrb处理的细胞相比，Aβ42处理的神经元突触素总表达减少，而美金刚修复突触素表达(图1D)。此外，突触素标记轴突长度的相对定量显示，Aβscrb处理的神经元轴突平均长度为81µm，而Aβ42处理的神经元轴突平均长度为35µm。与Aβ42处理的神经元相比，Aβ42+美金刚共处理的细胞轴突平均长度为60µm (图1E)。

突触后密度蛋白(PSD-95)是在成熟兴奋性神经元中表达的一种支架蛋白，在AD转基因体内模型中作为突触变性的报告蛋白。急性Aβ42治疗也观察到PSD-95的表达下降，而在Aβ42存在的情况下，美金刚恢复了PSD-95的表达。这些结果支持了Aβ42驱动的散发性AD的发病涉及NMDA受体信号调节的病理机制，其中美金刚恢复和维持了突触结构和完整性(图1F)。

图1.Aβ42破坏了突触连接

Tau神经原纤维缠结由聚集的β片直或成对螺旋细丝(PHF)组成，与阿尔茨海默病和额颞叶痴呆有关,在来自不同阶段AD (Braak阶段I/II, III/IV, V/VI)的死后脑样本中检测到tau磷酸化。例如，与健康对照相比，在BraakV/VI晚期，Ser202/Thr205的磷酸化增加了4至13倍，其中这些位点调节致病性原纤维tau的形成，表明这些位点的翻译后修饰可能作为严重AD相关痴呆的生物标志物。

为了验证tau的激活受到Aβ42寡聚物调控的假设，作者用5µM Aβ42急性处理hiPSC来源的皮质神经元72小时。分析了内源性tau蛋白PHF中Ser202/Thr205的磷酸化。与未处理的细胞相比，外源性Aβ42处理诱导内源性tau中Ser202/Thr205磷酸化，并增加了异常神经元体细胞簇中促凋亡的caspase 3的表达(图2A)。Z-stack分析揭示了Aβ42诱导的体细胞簇的三维结构。磷酸化的tau蛋白在簇的周围和轴突突起处被检测到，而切割的caspase3信号主要在空心中心被观察到(图2B)。相对定量的ICC分析证实，Aβ42在衰老皮质神经元中显著上调了caspase3的表达(图2C)。

由于皮质神经元用Aβ42寡聚物急性处理72小时可诱导凋亡信号，因此作者进行了受控的时间过程活力测定以更好地监测这种表型。一种泛激酶抑制剂staurosporine (STP)被用作细胞活力受损的阳性对照。为了排除药物介导的细胞毒性作用导致的活力丧失，神经元分别用5µM美金刚、10µM萨拉卡替尼、1µM罗利普兰或1µM多奈哌齐单独培养。同时，先用5µM Aβ42处理神经元1小时，然后用Aβ42加治疗药物共处理24小时、48小时和72小时。

用1µM STP孵育人类皮质神经元24、48和72小时后，其活力均受到影响。分别为70%、45%和30%活细胞(图S1A、S1D、S1G)。仅给予5µM美金刚、10µM萨拉卡替尼、1µM罗利普兰或1µM多奈哌齐治疗24小时，神经元活力无统计学意义变化。(图S1B, S1E, S1H)。与对照组相比，Aβ42诱导后，24小时和48小时神经元活力分别下降20%和40%，而在致病性Aβ42存在时，被测分子拯救并维持神经元活力(图S1C, 1F)。在72小时的治疗中，Aβ42诱导了更明显的50%的细胞毒性作用，而治疗分子则挽救了神经元的活力(图2D)。

接下来，进行Western blot分析以证实Aβ42诱导tau磷酸化。为此，作者使用了一种识别Ser202/Thr205位点磷酸化的PHF tau的抗体。美金刚、罗利普兰、萨拉卡替尼和多奈哌齐被纳入研究，以获得信号事件的机制(图2E)。用Aβ42寡聚物处理神经元显著上调tau Ser202/Thr205磷酸化，而萨拉卡替尼或美金新胺在Aβ42存在下降低了tau磷酸化(图2F)。通过药物治疗，这些在无血清条件下进行的实验强烈表明，Aβ寡聚物通过NMDA受体和Fyn/src介导的酪氨酸激酶信号轴在凋亡神经元簇中控制tau磷酸化，揭示了tau病变和淀粉样蛋白级联假说驱动神经变性之间的协同机制。

图2.Aβ42低聚物诱导Tau蛋白磷酸化

     神经元突触丧失被认为会降低长期增强(LTP)，而LTP与学习和记忆的形成有关。由于Aβ42通过突触小泡蛋白表达降低突触密度(图1)，而美金刚修复神经元间连接和活力(图2)，作者研究了美金刚对Aβ42处理神经元的电生理和LTP功能的支持作用。

为了记录神经元的电活动，hiPSC-皮质神经元被镀在定制的含有MEAs的氮化钛电极上，其中微流控芯片表面首先用细胞疏水性聚乙二醇(PEG)处理，然后用激光烧蚀去除电极周围的PEG，并用DETA(一种亲细胞有机硅烷化合物)进行回填。XPS证实了表面修饰。对于LTP的诱导和量化，在具有共定位皮层神经元的电极上施加500 mV、持续5 ms的高频刺激(HFS)。这种MEA表面修饰指导电极周围皮层神经元的模式，具有明确的突触连接和形态。

作者的平台允许测量超过5000个单个活神经元的基线电活动和LTP，揭示群体神经元动力学响应致病性Aβ42和治疗分子的强大功能特性。首先记录hiPSC皮层神经元的基线电活动。然后，HFS诱导LTP，并记录神经元反应。之后，用5µM Aβ42处理神经元1小时，然后记录。最后，系统与Aβ42和5µM美金刚共同处理以模拟治疗干预，然后在1，24，48和72小时进行记录。原始波函数是神经元动作电位的基本代表，表明Aβ42抑制了神经元的电活动。美金刚恢复并维持了72小时的记录(图3A)。为了证实这些原始波形是生物功能读出的指示，在记录结束时，神经元被利多卡因脉冲处理，这是一种已知的Na+通道阻滞剂和麻醉剂，消除了神经元的电活动。神经元放电的相对量化表明，神经元具有LTP能力，正如在HFS时观察到的放电率增加(图3B)。用Aβ42处理系统会抑制神经元电位，而在Aβ42存在的情况下，美金刚能在1、24、48和72小时内恢复神经元放电(图3B)。

通过全细胞膜片钳分析，对其他药物进行测试，以探寻其调节电生理的机制(代表性的原始轨迹如图S2A-K所示)。神经元在更大范围的DIV35-50中培养，以获得药物在体外的机制动力学的全局洞察，而不考虑特定的时间。对于向内的钠电流，在控制条件下没有检测到变化。而Aβ42显著降低了钠电流(图3C)。有趣的是，小分子美金刚处理的神经元显示出钠电流的显著改善，这表明突触NMDA受体调节钠稳态。与Aβ42相比，先用Aβ42处理神经元，然后与美金刚、萨拉卡替尼、多奈哌齐或罗利普兰共同处理神经元，表现出钠电流的恢复和维持。

    此外，Aβ42显著抑制钾电流，而用治疗性分子处理的细胞显示出这种功能的恢复(图3D)。美金刚处理神经元的钾电流有显著变化，尽管在钠电流中观察到更稳健的统计结果(图3C)。采用无间隙方案记录单个神经元的自发动作电位，得到神经元破裂的持续时间和幅度。Aβ42减少了自发动作电位爆发的持续时间(毫秒)，而治疗分子挽救了功能性爆发(图3E)。此外，Aβ42显著损害自发神经元爆发的振幅(毫伏)，其中分子恢复放电振幅(图3F)。该模型进一步有助于解决了药物在老化神经元体树突动作电位整合中的作用机制。

     由于神经系统疾病往往发生在老年，不同的研究小组已经尝试通过过氧化氢治疗或慢病毒介导的早衰蛋白递送来诱导神经元损伤和衰老细胞。衰老的过程与抗氧化剂产生减少和活性氧增加有关，从而导致细胞衰老和功能受损。线粒体电位和异常ROS的变化是人类iPSC衍生的神经元衰老表型的功能读出。

   为了研究ROS在Aβ诱导神经元衰老中的作用，作者用Aβ42处理衰老的div85 - hiPSC皮质神经元，然后用四甲基罗丹明乙酯(TMRE)标记线粒体。包括治疗分子以评估它们是否调节代谢功能。与对照组相比，Aβ42降低了线粒体膜电位，而治疗分子恢复了线粒体膜电位，但没有达到对照组的水平(图4A)。

   作者还研究了治疗药物是否会调节ROS，因为不平衡的ROS是衰老的标志，并有助于细胞构建块的恶化。皮质神经元体外培养75天，用Aβ42和治疗分子处理，然后使用细胞渗透试剂2,7二氯荧光素双乙酸酯(DCFDA)分析流式细胞术门控的单个活神经元的FITC-A通道中的ROS。Aβ42降低了ROS^positive总体百分比(%)(图4B)。这是由于Aβ42调节的细胞毒性作用(图2D)。与Aβ42处理的条件相比，Aβ42加治疗药物共同处理的神经元显示出总百分比ROS阳性群体的增加(图4B)，这与先前的观察结果一致，即治疗分子有助于活力(图2D)。获得平均荧光强度(MFI)值，代表被询问的单个活细胞中标记的ROS。当将MFI值与总百分比ROS阳性群体进行正常化时，很明显，Aβ42在存活细胞中异常上调ROS(图4C)。与Aβ42处理的神经元相比，Aβ42与美金刚、萨拉卡替尼、多奈哌齐或罗利普兰共同处理的神经元的ROS分别降低了1.0倍、0.53倍、0.48倍和0.54倍(图4C)。

DCFDA标记培养物的共聚焦显微镜证实，经Aβ42处理的活皮层神经元中ROS生成增加(图4D)，这与定量流式细胞术获得的结果一致(图4C)。此外，只有Aβ42处理的皮质神经元表现出异常大的三维ROS^positive簇，其中轴突从ROS^positive簇中伸出。为了鉴定Aβ42诱导的ROS种类，用荧光探针处理体外老化皮质神经元，该探针在超氧化物存在下容易氧化并发出荧光信号。老化神经元的共聚焦显微镜显示，与对照组相比，Aβ42增加了超氧化物的产生。这些Aβ42诱导的超氧化阳性簇在结构上类似于过度磷酸化tau和切割caspase3信号阳性的体细胞簇。

该模型能够在体外培养存活且具有功能的皮层神经元超过35天，用于Aβ驱动的神经元衰老的纵向研究。虽然治疗剂可以调节线粒体电位和ROS，但由于氧化剂和抗氧化剂之间的微妙平衡对最佳细胞稳态至关重要，因此尚不清楚这些分子是否能恢复最佳ROS水平。

图4.Aβ42加重了衰老hiPSC-皮质神经元体群中的ROS

细胞衰老是机体衰老的一个特征，衰老细胞已被证明对治疗干预具有抵抗力。氧化应激和线粒体受损与细胞衰老的基本生物学有关。由于Aβ42上调ROS并损害线粒体电位(图4)，因此进一步研究了Aβ42介导的内源性β-半乳糖苷酶(β-Gal)活性的调节作为替代衰老标志物。治疗分子5µM美金刚、1µM罗利普兰、10µM萨拉卡替尼和1µM多奈哌齐被纳入研究，以获得调节衰老的机制。帕博西尼被用作阳性对照，它已被证明在癌症中诱导衰老。此外，采用1µM槲皮素(Q)和10 nM达沙替尼(D)这两种被描述为针对衰老细胞的抗衰老药物，以评估它们是否调节神经元衰老。为了标记内源性β-半乳糖苷酶(β-Gal)活性，神经元用含荧光素的探针孵育，探针由两个半乳糖苷部分组成。

由于细胞衰老的发展是一个慢性过程，因此采用10nM Aβ42单独或联合分子对神经元进行慢性治疗共21天。长期治疗10nM Aβ42已被证明可以近似模拟病理生理条件，损害神经元电生理而不影响生存能力。结果显示，与对照组相比，帕博西尼增加了div70老化皮质神经元中β-Gal活性。令人惊讶的是，慢性10nM Aβ42处理诱导衰老相关β-Gal活性显著增加。相比之下，长期与Aβ42和治疗分子共处理的神经元表现出β-Gal活性降低至低于帕博西尼处理样品的水平(图5A)。

衰老细胞分泌衰老相关分泌表型(SASP)，这是一种促炎因子的混合物，通过自分泌和旁分泌信号诱导细胞周期停滞。由于结果表明Aβ是神经元衰老的驱动因素，接下来定量分析条件培养基中皮质神经元分泌的全局蛋白质组细胞因子和趋化因子。与对照组相比，Aβ42诱导炎症相关的白细胞介素-18 (IL-18)分泌增加。与Aβ42处理的细胞相比，Aβ42加治疗药物处理的皮质神经元在培养基中IL-18的分泌也增加(图5B)。

此外，Aβ上调皮层神经元分泌巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)，这是一种先前描述的AD患者脑和脑脊液样本中的神经保护因子。有趣的是，美金刚支持MIF的分泌。相比之下，与Aβ42治疗相比，萨拉卡替尼、罗利普兰和多奈哌齐降低了MIF分泌(图5C)。这些结果揭示了美金刚潜在的一种新的神经保护模式，支持MIF分泌对抗致病性Aβ。单核细胞趋化蛋白1 (MCP-1)存在于阿尔茨海默病患者的大脑和血浆中，与认知能力下降速度加快和左内侧颞叶体积下降有关。尽管Aβ42增加了MCP-1的神经元分泌，治疗性分子美金刚、萨拉卡替尼、罗利普兰和多奈哌齐却降低了皮质神经元分泌MCP-1(图5D)。

纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1，也称为SERPINE1)通过抑制尿激酶和组织型蛋白酶激活物的催化活性，调节血栓形成和纤溶之间的平衡，是多器官纤维化的致病因子。AD患者脑和血浆中PAI-1水平升高，与认知功能受损相关。Aβ42上调皮质神经元的PAI-1分泌。与Aβ42处理相比，美金刚降低PAI-1水平与未处理细胞相似。神经元与Aβ加萨拉卡替尼、罗利普兰或多奈哌齐共处理后，PAI-1分泌减少(图5E)。接下来，将DIV45神经元中的β-Gal标记为慢性10 nM Aβ处理诱导衰老的额外证据。在未处理的老化神经元中出现了一些衰老群体，其中Aβ42异常促进了具有跨轴突的体细胞簇中衰老群体的出现(图5F)。总体而言，Aβ上调衰老皮质神经元促炎因子的分泌，治疗药物对神经元炎症的调节呈异质性(图5G)。这些由老化皮质神经元分泌的炎症因子先前在诊断为MCI和AD的患者的大脑、血浆和CSF中被检测到(表1)。测试的治疗分子调节神经元SASP。美金刚支持MIF的分泌，强调了一种新的针对皮层神经元致病性Aβ42的神经保护模式。

表1.在MCI和AD患者中检测到衰老的皮质神经元分泌年龄风险炎症因子

  结果六：衰老神经元分泌的促炎因子与人类年龄相关疾病有关

氧化损伤的增加和年龄引起的炎症之间存在正相关。例如，在住院老年人的血浆中检测到较高浓度的炎症因子和氧化损伤标志物，这进一步与认知受损有关。据估计，65岁后阿尔茨海默病的发病率每5年翻一番，这对引发一系列神经退行性事件的内在病理生理机制提出了疑问。因此，作者研究了在缺乏Aβ的情况下，衰老的皮质神经元是否能分泌促炎因子来驱动其内在变性。收集无血清培养基，然后对分泌的细胞因子和趋化因子进行全局多重分析，以纵向识别分化后75天的年龄相关促炎标志物。

      结果一致表明，皮质神经元在体外分化后35-45天上调促炎因子的分泌，在体外分化后75天达到峰值。皮质神经元增加了MCP-1(图S3A)、衰老相关的PAI-1(图S3B)、MIF(图S3C)和IL-18(图S3D)的分泌。最后，其他人类疾病和年龄驱动因子如CXCL-10(图S3E)、CD40-配体/CD154(图 S3F)和IL-8(图S3G)的分泌也有统计学上的显著增加。DIV75组也检测到白细胞介素-21 (IL-21)升高。由于已鉴定的标记物被描述为由衰老细胞分泌，因此在DIV25-75培养的皮质神经元中评估了内源性β-Gal表达。与趋化因子/细胞因子结果一致，相图显示DIV45-75之间出现了衰老β-gal阳性皮质神经元亚群，而DIV25没有发现β-gal阳性细胞(图S3H)。

图5.Aβ42是通过分泌炎症因子导致神经元衰老的驱动因素

     小结

作者这项工作展示了一个以人类为中心的衰老模型，该模型概括了神经元衰老和AD的主要特征，此外还以LTP的形式提供了神经元电活动的平行测量，以实时响应致病性Aβ和治疗药物。该模型显示Aβ42导致神经元LTP和电生理功能受损，诱导体细胞异常聚集，Aβ优先聚集在细胞膜突起中，导致异常起泡、细胞形态缺陷和细胞凋亡。并且，Aβ诱导内源性PHF tau中Ser202/Thr205的磷酸化，在过度磷酸化tau阳性的凋亡神经元簇中损害线粒体电位并增加ROS(如超氧化物)。治疗性分子可以调节了ROS水平。作者还揭示了Aβ42驱动神经元衰老。尽管美金刚、萨拉卡替尼、罗利普兰和多奈哌齐这些治疗AD的药物可以挽救经Aβ42处理的神经元的LTP和电生理，但这些分子只能减弱却不能阻止Aβ42驱动的神经元衰老。槲皮素和达沙替尼，作为破坏衰老细胞和减少脑脊液中衰老相关生物标志物的候选药物正在进行临床研究。

  当前，在发现和开发治疗阿尔茨海默病的新治疗方法方面取得的进展一直受到临床试验失败率高的困扰。而这个由体外无血清条件下的人类iPSC皮层神经元组成的衰老模型再现了阿尔茨海默病的特征，并揭示了神经元对治疗药物反应的功能行为的宝贵平行信息。这项技术将神经元功能与衰老生物标志物原位实时结合起来，因此，对药物筛选/发现项目非常有用，可以揭示人类神经系统疾病的治疗方法。