研究团队首先在南方医科大学珠江医院招募了59名UIA患者和50名RIA患者，对其粪便标本进行了宏基因组鸟枪测序分析，用于评估RIA和UIA组中肠道微生物群的分类特征。研究结果发现，与UIA相比，RIA阶段的患者肠道微生物组发生了变化，其中，在RIA患者的粪便样本中Klebsiella pneumoniae 和 Ruminococcus gnavus的丰度水平显著升高，而Bifidobacterium breve, Bifidobacterium pseudocatenulatum和Fusicatenibacter saccharivorans的丰度水平显著降低。这些发现表明，IA患者肠道微生物群特征变化可能与IA进展有关。

图2 粪便宏基因组学分析显示IA患者不同阶段肠道微生物群的微生物组成发生了变化。（A）箱线图显示了UIA和RIA组之间的α多样性比较，包括丰富度、chao1指数、Shannon指数和Simpson指数。（B）β多样性比较，基于Bray-Curtis距离的PCoA，表明组之间的分布不同。（C）UIA和RIA组间差异丰富的特征线性判别分析（LDA）评分直方图。

为了进一步确定RIA患者粪便中发生的微生物代谢过程，研究团队利用KEGG Orthology数据库对微生物基因进行注释，发现色氨酸代谢相关基因在RIA相关的微生物群中显著富集，而与磷酸戊糖途径相关的基因在UIA相关的微生物组中显著富集。其中，色氨酸酶基因的表达在RIA患者粪便微生物中显著上调。

图3 RIA和UIA组中具有代表性KEGG途径、KO基因以及代谢-酶反应。（A） UIA和RIA中的差异代谢途径。（B）RIA中富集的色氨酸代谢途径基因。（C）色氨酸吲哚代谢途径。（D）贡献色氨酸酶表达的微生物群组间比较。*p<0.05、**p<0.01。

考虑到微生物代谢基因功能的改变会导致宿主循环代谢产物水平的变化，研究团队收集了来自南方医科大学珠江医院的30名RIA患者和30名UIA患者的血浆样本，进行了非靶向代谢组学研究。52种差异代谢物被鉴别为差异代谢物（p<0.05，VIP>1），其中33种代谢物在RIA患者血浆中显著增加，主要包括氨基酸和吲哚化合物；19种代谢物在UIA患者血浆中显著增加，主要包括胆汁酸类代谢物。

图4 非靶向代谢组学分析显示，与UIA相比，RIA患者的代谢特征发生了变化。正离子模式和负离子模式下UIA和RIA组之间血浆代谢物的分离分别如A、B所示。（C）热图显示了基于非靶向代谢组学分析的参与者的特定代谢特征。（D）箱线图展示了组间10种选定差异代谢物的比较。代谢物丰度在log2转化后，被可视化。*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。

为了进一步定量证实非靶向代谢组学发现的微生物群相关代谢物的差异，我们对来自两个不同地理区域的IA患者的血浆样本进行了靶向代谢组学检测，其中来自珠江医院的162名UIA患者和97名RIA患者作为发现队列，来自首都医科大学北京天坛医院的49名RIA患者和195名UIA患者被作为独立验证队列。研究结果显示，在两个中心的队列中，五种胆汁酸代谢产物（鹅去氧胆酸、甘鹅脱氧胆酸、脱氧胆酸、甘鸡脱氧胆酸和12-酮石胆酸）在两组间存在显著差异。同时，四种色氨酸代谢产物，包括IS、5-羟基色氨酸、犬尿氨酸和色氨酸在RIA组中显著增加。研究团队通过随机森林模型构建了一个由IS、5-羟色氨酸和犬尿氨酸组成的代谢物组合，该组合可以区分RIA患者和UIA患者，其在测试集中的组合AUC为0.974，在外部验证集中为0.972代谢物组合，这一代谢物组合或可用于发现IA进展的发病机制，甚至预测动脉瘤的破裂。

图5 随机森林模型的筛选的RIA和UIA代谢标志物。（A）研究随机森林模型的设计和流程图。（B）候选代谢产物用于分类UIA和RIA。（C）测试集的ROC曲线。（D）验证集的ROC曲线。（E）两个队列中代谢标志物含量的箱形图。代谢物丰度在log2转化后，被可视化。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.005，***p<0.001。

为了进一步探索肠道微生物群和与IA进展相关的代谢产物之间的关系，我们进行了差异菌群和机器学习筛选出的差异代谢物间的Spearman相关性分析以及具有显著差异菌群、KEGG通路和差异代谢产物的中介分析。结果提示IS水平的增加与色氨酸代谢途径和K. pneumoniae密切相关，这可能部分解释RIA和UIA具有上述不同特征的原因。

图6 综合宏基因组和代谢组分析揭示了RIA患者分类群和代谢产物之间的关联。（A）热图详细说明了RIA与UIA中差异丰富的不同代谢物和微生物类群之间的相关性*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。（B）桑基图显示了细菌种类、其相应的KEGG代谢途径和由此产生的色氨酸代谢产物之间的联系。（C）网络图描绘了微生物群、硫酸吲哚酚和色氨酸代谢途径之间的复杂相互作用。（D）中介分析图定量评估了特定细菌分类群对中心代谢产物水平的贡献。

IS主要来源于肠道中的色氨酸，经肠道微生物色氨酸酶的作用下可生成吲哚，吸收入血后运至肝脏经氧化和硫酸化合成IS[2]。为了验证肠道微生物群改变与血浆IS的相关性，对进行抗生素混合物（ABX）治疗的IA小鼠进行了IS水平检测。结果显示抗生素耗竭肠道微生物群能够有效降低小鼠血浆中IS的浓度（P=0.0102）。同时，与不使用ABX的IA小鼠相比，ABX治疗显著减少了动脉瘤的形成（IA vs ABX+IA: 81.82% vs 36.36%；P=0.0301）和破裂（IA vs ABX+IA: 63.64% vs 9.09%；P=0.0078）。此外，我们想证实ABX治疗对IA小鼠的保护作用是依赖于肠道微生物群耗竭后血浆IS的减少。通过向ABX处理的小鼠腹腔注射IS，发现IS腹腔注射使接受ABX治疗的IA小鼠的血浆IS水平正常化（P=0.0052），并显著增加了IA的发生率（ABX+IA vs ABX+IS+IA: 36.36% vs 81.82%；P=0.0301）和破裂率（ABX+A vs ABX+S+IA: 9.09% vs 54.55%；P=0.0221）。

IA的形成和破裂与脑动脉中细胞外基质的破坏密切相关。研究团队发现肠微生物群耗竭后，小鼠脑动脉中弹性蛋白的降解减少，脑动脉壁MMP9的表达下调（P=0.0285）。当向接受ABX治疗的IA小鼠补充IS可上调了MMP9的表达（P=0.0482）并增强弹性蛋白降解。结果提示宿主血浆中的IS水平受肠道微生物群的调节，血浆IS水平的升高增加了IA的发生率和破裂，这可能与脑动脉MMP9表达的上调和弹性蛋白降解有关。

图7 IS增加了ABX治疗小鼠IA的形成和破裂。（A）实验方案。在右肾切除术前2周开始并持续2周的口服ABX治疗耗尽了肠道微生物群。在右肾切除术前2周开始腹膜内注射IS，并持续到实验结束。（B）每组小鼠大脑底部脑血管的代表性图像。独立实验至少重复五次。（C）诱导后21天动脉瘤的发生率（n=11）。（D）小鼠的累积无症状曲线显示了各组症状出现的时间过程（n=11，对数秩（Mantel Cox）检验）。（E）通过LC-MS/MS测量小鼠血浆中的IS水平（IA组n=7，ABX+IA组n=6，ABX+IS+IA组n=6）。（F）用H&E染色的脑动脉的代表性图像（上部；比例尺，50µm）和用维多利亚蓝染色的脑血管的代表性图（下部；比例尺，50µm）。独立实验至少重复五次。*p<0.05，**p<0.01（G）各组动脉瘤壁MMP9表达的代表性图像和定量（比例尺，100µm）。（n=4）*p＜0.05。

本研究揭示了肠道微生物群衍生的色氨酸代谢物作为区分RIA和UIA患者的生物标志物的潜力，为IA的破裂风险判断提供了一种潜在的非侵入性的评估方法。同时，提出了肠道微生物群衍生的IS在IA壁弹性蛋白降解中发挥的作用，为IA的发病机制提供了新的见解。此外，该研究强调了进一步研究肠道微生物群衍生的组学特征与IA风险之间潜在关联的必要性，将为颅内动脉瘤的诊断和治疗开辟新的途径。

研究通过对肠道微生物组和代谢组的大规模综合分析，揭示了IA不同阶段的独特微生物组和代谢组特征。我们的研究观察到RIA中 Klebsiella，Alistipes，和Enterobacteriaceae的富集，这些微生物均为众所周知的吲哚产生菌。色氨酸酶基因在RIA患者的肠道微生物群中表达上调，色氨酸代谢通路显著激活，其中色氨酸可通过吲哚途径转化为吲哚，入血后在肝脏中会进一步生成IS。相应地，通过非靶向和靶向代谢组学观察到，RIA患者血浆中的IS水平显著升高。相关分析和中介分析提示，IS水平的升高与肠道微生物群的分类与功能特征改变密切相关。随后的动物实验进一步证实了肠道微生物对血浆IS水平的调控，小鼠肠道菌群的耗竭与血浆IS水平的降低相关，从而减少动脉瘤壁MMP9的表达与弹性蛋白的降解，这可能有助于其对IA进展的保护作用。

硫酸吲哚酚是一种尿毒症毒素，在慢性肾脏疾病患者中明显升高。先前的研究已经证明它与肾病患者的粪便微生物群落改变之间存在显著相关性。在本研究中，尽管RIA组患者血浆IS浓度是UIA患者的两倍，但仍未达到肾功能衰竭患者的水平。本研究提示即便IS未达到肾功能衰竭患者的水平，IS可能对IA的进展产生持续的破坏性影响。此外，进一步的前瞻性研究对于患有慢性肾脏病的UIA患者是否在面临更高的破裂风险至关重要。

目前我们的体内研究只是对IS参与动脉瘤进展的初步探索，其确切机制有待进一步研究。一方面，需要进一步进行体内外验证明确特定肠道微生物的色氨酸代谢与IA进展之间的因果关系；另一方面，进一步探索IS如何激活炎症细胞浸润以及调节血管平滑肌细胞、内皮细胞或炎症细胞中炎症因子的表达具有重要价值。此外，可降低血浆IS的药物或具有药物治疗IA的潜力，有待进行进一步的基础和临床研究。

此外，本研究识别的肠道微生物衍生的差异代谢物，可能为预测IA的破裂风险提供了新的视角。然而，确实很难确定生物标志物的变化是由动脉瘤的进展还是SAH后的稳态紊乱引起的。为了确定破裂风险评估的生物标志物组合的作用，应进行大规模前瞻性队列研究以及进一步的体内外基础研究，以证实当前的工作。