【中国声音】张荣教授团队：全外显子组测序首次揭示了中国人颅内生殖细胞肿瘤的新遗传特征

近日，复旦大学附属华山医院神经外科张荣/黄翔教授团队在《Histopathology》（IF: 6.4/Q1）发表题为“全外显子组测序揭示了新的中国人颅内生殖细胞瘤的基因特征”的研究论文。该研究最新发现在中国人队列中RELN和SYNE1的高表达与颅内生殖细胞肿瘤的发生存在高度相关性。这一发现有助于为未来颅内生殖细胞肿瘤的诊断与治疗提供线索。复旦大学附属华山医院神经外科黄翔医师、黄建涵博士为本文共同第一作者，张荣教授为通讯作者。

第一作者：黄翔、黄建涵

通讯作者：张荣

作者单位：复旦大学附属华山医院

REF: Huang Xiang,Huang Jianhan,Zhou Xiaoyu et al. Whole-exome sequencing has revealed novel genetic characteristics in intracranial germ cell tumours in the Chinese.[J] .Histopathology, 2024, 84: 1199-1211.

目　的

颅内生殖细胞瘤（Intracranial germ cell tumor, IGCT）是一种罕见的中枢神经系统肿瘤，主要发生于儿童和青少年，不同人群的发病率和分子特征差异很大。中国人群中IGCT的遗传改变尚不清楚。

方法与结果

本研究纳入47例患者，采用全外显子组测序（WES）对其肿瘤标本进行分析。我们发现KIT是最显著的突变基因（15/47，32%），主要发生在生殖细胞瘤组（13/20，65%），较少发生在NGGCT组（2/27，7%）。FGF6和TFE3的拷贝数变异仅出现在NGGCT患者中（P=0.003和0.032），而CXCR4、RAC2、PDGFA和FEV的拷贝数变异仅出现在生殖细胞瘤患者中（CXCR4的P=0.004，后三个基因的P=0.027）。与之前的日本队列相比，中国人的RELN和SYNE1体细胞突变率更高。预后分析显示，NF1突变与IGCT患者的总生存期和无进展生存期缩短有关。克隆进化分析揭示了在疾病监测期间发生组织学亚型或分化程度变化的两例IGCT患者的早期分支进化模式。

结　论

本研究提示中国IGCT患者可能具有明显的遗传特征，并发现了几种可能的遗传改变，这些改变有可能成为NGGCT患者预后的生物标志物。

关键词

颅内生殖细胞肿瘤，全外显子组测序，NF1，KIT/RAS通路

背景介绍

颅内生殖细胞瘤（IGCT）是一种罕见的中枢神经系统肿瘤，异质性高。在组织学上与性腺生殖细胞肿瘤相似，约占颅内肿瘤的1-3%^[1]。它可分为6个亚型，即生殖细胞瘤、畸胎瘤、卵黄囊肿瘤、绒毛膜癌、胚胎癌和混合生殖细胞肿瘤^[2]，后5个亚型可归类为非生殖细胞肿瘤（non-germinomatous germ cell tumors, NGGCT）。一般而言，生殖细胞瘤约占IGCT的60%~70%，而NGGCT仅占约20~30%^[3]。手术是IGCT患者的主要治疗方法^[4,5]。生殖细胞瘤患者对放化疗敏感，5年生存率可超过90%^[6,7]，但这些治疗方法对NGGCT患者无效，其5年生存率低于患者的60%^[8]。虽然NGGCT对铂类化疗方案高度敏感，但复发率可达50%~70%^[9]。探索恶性表型背后的分子驱动力和发现新的预后标志物对IGCT，特别是NGGCT至关重要。

发病率的显著地理差异是IGCT的另一个重要特征。IGCT的发病率在韩国约为340/万/年^[10]，在日本约为270/万/年^[11]。相比之下，IGCT在欧洲国家和美国的发病率要低得多。美国仅为60万/年，欧洲为1.0万/年^[4,11]。此外，对IGCT的分子特性研究有限。Wang等报道，罕见的JMJD1C种系变异在IGCT患者中显著富集，该队列主要由日本人群组成^[12]。然而，IGCT在中国人群中的遗传改变尚不清楚。

为了进一步探讨中国人群中IGCT患者的遗传变异特征，我们招募了47例IGCT患者（20例为生殖细胞瘤，27例为NGGCT），对肿瘤和匹配的血液DNA进行了全外显子组测序（WES）分析。探讨生殖细胞瘤和NGGCT患者不同的分子特征，分析遗传改变与预后的相关性。

方法

患者和样本

2018-2020年在华山医院招募47例IGCT患者。

纳入标准：a.患者均为中国人。b.独立病理学家根据2016年WHO分类^[13]诊断颅内GCT。c.有足够的新鲜冷冻或石蜡包埋的肿瘤组织可用于DNA提取。排除标准：非GCT患者。

所有涉及人类参与者的程序均符合《赫尔辛基宣言》(2013年版)。所有患者均签署知情同意书，研究设计经华山医院伦理委员会批准[HIRB 2020-230]。从每位患者身上采集肿瘤组织和匹配的正常血液。H&E染色的肿瘤组织切片由病理学专家复查，确保肿瘤含量在20%以上。临床记录从医院电子病历中获取。

全外显子组测序

使用Maxwell RSC血液DNA试剂盒（cat# AS1400, Promega）提取速冻组织和外周全血中的DNA，使用MagMAX FFPE DNA/RNA Ultra试剂盒（cat# A31881, Thermo Fisher）提取福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织中的DNA。用Covaris L220超声仪对纯化DNA进行剪切。使用来自Agilent SureSelect XT Human All Exon V7 kit（cat# 5991-9039, Agilent）的探针与DNA片段杂交。PCR扩增和末端修复后，使用SureSelect XT HS和Low Input Library Preparation Kit for ILM（Pre-PCR）Kit（cat# G9704, Agilent）将捕获的DNA连接到适配器和条形码上。文库在Illumina NovaSeq-6000测序仪（Illumina, USA）上测序。使用Burrows-Wheeler alignment算法和Genome Analysis Toolkit（GATK, version 3.5）去除适配器和低质量reads后，将reads与hg19对齐。

生物信息学分析

使用Burrows-Wheeler Aligner比对算法和Genome Analysis Toolkit（GATK, version 3.5）去除适配器和低质量reads后，将reads与hg19对齐。应用MuTect算法识别肿瘤中候选体细胞单核苷酸变异（SNVs），并与来自每个患者的匹配对照血液样本进行比较。SNV注释采用ANNOVAR进行。在单样本模式下，Varscan检测到等位基因频率≤0.05%的罕见种系变异。体细胞拷贝数变异（CNV）使用ExomeCNV来命名^[14]。突变签名分类基于COSMIC mutational signature（version 2 - March 2015），该签名来源于他人的研究^[15-17]。使用MISA (http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/misa.html)对GRCh37/hg19中长度为1-5 bp重复亚基且包含5个或更多重复序列的所有常染色体微卫星链进行鉴定，并用于计算微卫星不稳定性评分（MSI）。MSI评分由不稳定微卫星站点数/有效站点总数计算。MATH分数采用maftools计算VAF分布的宽度^[18]。

系统发育分析

在进行系统发育分析之前，首先计算每个样本的体细胞突变位点，然后使用GATk CollectAllelicCounts软件从bam文件中提取每个SNV位点的等位基因计数。从facet的结果中提取每个点的CNV和LOH状态，根据Allelic Counts计算每个SNV位点的VAF，然后将提取的SNV位点、CNV和LOH输入PyClone主程序，计算每个患者每个样本中所含的克隆数^[19]。基于两个样本间各突变的细胞流行度二维图和各克隆在各样本中的分布，利用CITUP软件推断各克隆间的进化关系^[20]，并利用Timescape和Mapscape软件对结果进行可视化处理。

统计分析

使用R语言（version 4.0.3）或SPSS 25 for Windows（SPSS Inc.， Chicago, IL, USA）进行统计分析和数据可视化。患者亚组间的体突变分布、突变特征、临床特征的差异，分类参数采用Pearson卡方检验或Fisher精确检验，连续参数必要时采用Mann-Whitney U检验，P<0.05为差异有统计学意义。

结果

IGCT患者的临床病理及流行病学资料

为了探索中国人群中IGCT患者的分子特征，研究人员对2018年至2020年入组的47例手术切除并首次诊断的IGCT患者进行了全外显子组测序（WES）。患者的临床病理特征见表S1，并通过Sanger测序进行验证（图S1）。女性7例，男性40例。患者年龄中位数为13岁（范围0~30岁），超过12岁的患者29例（61.7%）。所有IGCT患者中，生殖细胞瘤20例，混合性肿瘤17例，成熟畸胎瘤5例，不成熟畸胎瘤3例，卵黄囊瘤2例。即生殖细胞瘤占42.6% （20/47），NGGCT占57.4%（27/47）。18岁以上的9例成人患者中有8例为NGGCT。松果体和鞍区是主要的肿瘤区域。28例（59.6%）位于松果体区，7例（14.9%）位于鞍区。根据α-胎儿蛋白（AFP）和β人绒毛膜促性腺激素（β-hcg）的表达水平，15例（31.9%）患者可分为分泌型（AFP>25ng/mL和/或β-hcg>50IU/L）。此外，我们还比较了生殖细胞瘤和NGGCT患者的临床病理特征，结果见表1。NGGCT患者松果体区的发病率略高于生殖细胞瘤患者，但差异无统计学意义（66.7% vs 50.0%， P=0.197）。此外，AFP在27例NGGCT患者中有14例显著升高，而在20例生殖细胞瘤患者中AFP均未升高（P<0.001）。生殖细胞瘤只有2例复发，无患者死亡，而NGGCT有5例复发（0%比18.5%），4例死亡（0%比14.8%）。

图S1. Sanger测序证实RELN和SYNE1突变的例子。

表1. 本研究患者的临床病理特征(N=47)。

IGCT患者的体细胞和种系突变谱

47例IGCT患者行WES，肿瘤文库中位深度为257x，白细胞DNA文库中位深度为117x。中位肿瘤突变负荷（TMB）在生殖细胞瘤组（1.86个突变/Mb）和NGGCT组（2个突变/Mb）之间相似，无统计学差异（Mann-Whitney U检验，P=0.232）（图1A）。NGGCT的MSI评分远高于生殖细胞瘤（Mann-Whitney U检验，P<0.001）（图1B）。数学评分，肿瘤内异质性的定量测量，在生殖细胞瘤和NGGCT之间没有差异（图1C）。

图1. 生殖细胞瘤和NGGCT患者的基因组图谱比较。(A)肿瘤突变负荷(TMB)， (B)微卫星不稳定性(MSI)评分，(C)数学评分。

前20个突变基因如图2A所示。KIT（32%）、RELN（15%）、SYNE1（13%）、KRAS（11%）和BIRC5（9%）是IGCT中前5位突变基因。这些基因融合成7个主要的致癌信号通路：KIT-RAS（在68%的肿瘤中发生改变）、NOTCH（38%）、HIPPO（34%）、WNT（26%）、PI3K（15%）、TP53/Cell Cycle（11%）和MYC（6%）（图2B）。我们还注意到KIT和RELN具有互斥关系，这与基因相互作用分析的结果一致（图S2）。有趣的是，KIT在生殖细胞瘤患者中具有最高的突变率，而RELN在NGGCT患者中具有最显著的突变（图2A）。

图2. IGCT患者的突变图。(A)生殖细胞瘤和NGGCT中前20个体细胞突变基因概述。(C)基因体细胞突变的生殖细胞瘤(左)和NGGCT(右)样本的通路图。(C)生殖细胞瘤与NGGCT的体细胞差异突变基因。点和横条分别表示危险率和5-95%置信区间(CI)。(Fisher精确检验，**：p值<0.001，NS：不显著)。(D)日本队列和中国队列体细胞突变率的比较分析。(E) KIT突变热点。

图S2. 47例IGCT患者预测基因相互作用的热图。色阶表示-log10 p值。绿色表示共生，紫红色表示互斥。显著p值用符号表示。*：p<0.05；+：p<0.1。

对比生殖细胞瘤和NGGCT之间的体细胞突变，我们发现KIT是最显著的突变基因，主要发生在生殖细胞瘤组（图2C，在生殖细胞瘤中占65%，在NGGCT中占7%，P<0.001）。此外，我们还发现，KRAS、KMT2D、RELN、HNRNPA2B1、NF1、PSMD11基因突变在NGGCT患者中出现，但未达到统计学意义。

2016年，Ichimura等人报道了日本igct患者的体细胞突变谱^[21]。为了分析不同人群中患者的遗传变异，我们将日本队列与中国队列进行了比较（图2D、图S3和表2）。与之前的报道相似^[12,22,23]，KIT表现出最突出的突变，其突变率在两个队列之间没有差异（表2）。与日本IGCT相比，中国IGCT的RELN突变率更高(15%对0%，P=0.015)， SYNE1突变率更高（13%对0%，P=0.029）（表2）。我们发现，我国队列的BCORL1突变率低于日本队列，但差异无统计学意义（2% vs 8%，P=0.325）（表2）。

图S3. 本研究与之前在亚洲进行的两项研究的比较。(A) Wang L和Koichi Ichimura的20个突变基因的Venn图分析。(B) 3项研究中3项研究中生殖细胞瘤和NGGCT的比例。

表2. 日本队列和我国队列的体细胞突变比较分析。

接下来，我们分析了患者中KIT基因的突变位点。15例IGCT患者中发现了11个不同的突变位点，其中13例为生殖细胞瘤，2例为NGGCT。最常见的突变区域是17外显子的酪氨酸激酶II结构域（TK2），其次是11外显子的近膜结构域（JM）（图2E），这与Wang的队列一致^[12]。15例患者中有7例出现前者，包括p.D816A、p.D816Y、p.D820Y、p.D820G、p.N822K、p.N822Y、p.Y823D；15例患者中有6例出现后者，包括p.M552_Y553delinsN、p.W557R、p.W557G、p.V560del、p.V560G、p.Y568D。一名患者同时携带p.Y568D和p.D820Y突变。其余3例患者在细胞外结构域（26-524）发生KIT突变，其中2例在8外显子（p. D419del）， 1例在9外显子（p. f483l）（图2E）。

在我们的IGCT队列中仅检测到两种致病种系突变基因：MUTYH和RAD50，均发生在NGGCT患者中。JMJD1C是一种罕见的种系突变基因，在Wang的日本队列中显著富集（24%）^[12]，但在我们的中国队列中没有（P=0.002）。日本队列中其他最富集的种系突变USP35、CDK5RAP2和PCDH15在我们的中国队列中也未检测到（P分别为0.002、0.007和0.007）。结果表明，种系突变在不同种群间具有明显的变异模式。

IGCT患者的拷贝数变化

拷贝数变异（Copy number variation, CNV）是一种影响大量碱基对的复制或删除事件。接着分析IGCT中拷贝数扩增或缺失最多的20个基因（图3A）。除组蛋白编码基因外，ARAF（36%）、CCND2（32%）和ACKR3（30%）为前3位扩增基因。FGF6和TFE3拷贝数扩增仅在NGGCT患者中出现（分别为37%和22%），而在GE患者中未出现（图3B，P=0.003和0.032）。相比之下，CXCR4、RAC2、PDGFA和FEV的拷贝数变异仅在生殖细胞瘤患者中出现（30%的CXCR4和20%的后三个基因），而在NGGCT患者中没有出现（CXCR4的P=0.004和后三个基因的P=0.027）。此外，与生殖细胞瘤患者相比，NGGCT患者在ATP2B3和GATA1上的拷贝数变异更频繁，而生殖细胞瘤患者在FGF3、OLIG2和几个组蛋白编码基因上的拷贝数变异更频繁。

图3. 生殖细胞瘤和NGGCT患者拷贝数差异(CNVs)。(A)前20个具有CNVs的基因概述。(B)生殖细胞瘤与NGGCT间的CNVs。点和横条表示危险率和5-95%CI。(Fisher精确检验，*：p值<0.05，NS：不显著)。

突变谱和突变签名

碱基替换的6个亚型（C>T、T>G、T>C、C>A、T>A和C>G）在snv中的分布不均匀（图4A）。T>G是IGCT中最常见的替代（生殖细胞瘤为35%，NGGCT为43%）。生殖细胞瘤中T>A的比例高于NGGCT（5% vs 3%， Mann-Whitney U检验，P=0.045）。患者的COSMIC突变特征如图4B所示。与BRCA1/2突变相关的特征3在所有样本中占主导地位，中位数百分比为36.7%，其次是特征1（7.3%）。所有特征在生殖细胞瘤和NGGCT之间无统计学差异（Mann-Whitney U检验，P>0.05）。

图4. 生殖细胞瘤和NGGCT患者的单核苷酸和复合突变特征。(A)生殖细胞瘤组和NGGCT组中6个单核苷酸取代的百分比箱形图。(B)生殖细胞瘤组和NGGCT组COSMIC三核苷酸突变特征百分比的堆叠条形图。替换的类型是用颜色编码的。

分泌型和非分泌型NGGCT患者基因改变分析

AFP和β-HCG是两个关键的血清标志物，已被证明与IGCT患者的预后相关^[24,25]。生殖细胞瘤患者经放化疗后5年生存率可达90%以上^[26]。因此,我们27 NGGCT患者分为分泌组（AFP升高和/或高βhcg，n=15）和一个非机密的组（n=12）（表1）。非机密的组VWF变异率高于分泌组（33%比0%，P=0.028）（图5）。基因拷贝数异变的进一步分析表明，几个基因拷贝数放大明显丰富分泌组，包括ATP6AP1（P=0.003），是（P=0.003），TFE3 （P=0.003），RBM10（P=0.003），MAGEA1（P=0.003）、DUSP9（P=0.010）、BCORL1（P=0.010）、BCL6（P=0.028）、GATA1）P=0.037）和ATP2B3（P=0.037）。而分泌组未见CNV显著富集。

图5. 分泌型和非分泌型NGGCT患者的不同基因改变。(A)分泌和非分泌NGGCT组的体细胞差异突变基因。(B) NGGCT分泌组和非分泌组的CNVs。点和横条分别表示危险率和5-95%可信区间(CI)。(Fisher精确检验，*：P<0.05，NS：不显著)。

IGCT患者的生存分析

我们进一步筛选与预后相关的基本临床因素和遗传生物标志物。5例患者复发，4例患者死亡（表1）。单因素Kaplan-Meier分析显示，5个基因（NF1、HNRNPA2B1、KMT2D、KMT2C和SMC1A）的突变和2个基因（ARAF和CDKN1C）的CNVs与无进展生存期（PFS）相关。对临床因素（性别、年龄、组织学亚型、AFP、β-HCG、治疗）及其他分子指标（TMB、MSI评分、MATH评分）进行分析，均未发现与PFS有统计学意义的相关性。与OS相关的因素有四个：NF1突变、AFP升高、分泌亚型和放疗。我们注意到NF1突变患者的OS和PFS比没有NF1突变的患者短。

由于颅内生殖细胞瘤和成熟畸胎瘤的预后较好，我们将其排除在生存分析之外，只留下21例患者进行进一步的生存分析。我们发现只有TP53突变与较短的OS相关，突变率为9.5.5（2/21）（P=0.015）。

两例患者的系统发育分析

47例患者中有2例（P23和P26）在疾病监测期间出现组织学亚型或分化程度的变化。P23，一名10岁男孩，最初被诊断为生殖细胞瘤（图6A），根据C-Kit表达降低，1年后转化为畸胎瘤。P26，一名20岁男性，最初诊断为成熟畸胎瘤（图6B），3个月后转为未成熟畸胎瘤，AFP明显上调。为了探讨初诊肿瘤与复发肿瘤之间的关系，我们对每位患者的配对肿瘤标本进行WES，并分析其克隆进化过程。二维癌细胞图谱（CCF）在2例患者中发现了几个突变簇的不同分布（图7A, 7B）。克隆0包含簇0突变，这表明这些突变存在于最初诊断和复发肿瘤的最近祖先细胞中。当P23复发时，最初诊断肿瘤中出现的克隆7（含ARID1A和KEAP1突变簇7和8）被消除，克隆1-6（对应于集群1到6）进化为显性克隆（图7A, C）。在P26中，分别位于y轴和x轴上的克隆1（含集群1）和克隆2（含集群2）由克隆0（含SMARCA4和EP300突变）进化而来（图7B；D）。克隆2包含三个驱动基因（FAT1, PBRM1和ZFHX3）的突变，这些突变几乎是最初诊断的肿瘤所特有的。克隆1中的额外突变可能提供生长优势，导致复发肿瘤细胞中克隆1的比例增加。也就是说，在肿瘤转化之前已经产生了复发特异性克隆。

图6. 两例初诊肿瘤和复发肿瘤的病理结果。(A) P23原发肿瘤和复发肿瘤的HE和C-Kit染色。放大，×20。(B) P26原发和复发肿瘤的HE和AFP染色。放大，×10/×40。

图7. 两例患者克隆进化分析。二维分析P23 (A)和P26 (B)的肿瘤。二维图中颜色表示不同的簇。P23 (C)和P26 (D)的鱼图。颜色表示鱼图中的不同克隆。图中显示了克隆中检测到的驱动基因。

讨论

在这项研究中，我们分析了47名中国IGCT患者的体细胞突变、CNVs和突变特征，并确定了不同亚型之间的分子差异。我们将该队列与先前发表的队列进行比较，发现同一疾病不同人群的突变景观存在显著差异。我们还确定了一些预后生物标志物，可能为指导治疗和监测进展提供潜在的效用。我们首次分析了IGCT的克隆进化过程，探讨了初始诊断肿瘤和配对复发肿瘤在组织形态学和分子亚型上的肿瘤内异质性。

KIT是在生殖细胞瘤患者中突变最为显著的基因，这与以往的研究结果一致^[12,22,23]。KIT是一种依赖配体的激酶，它的突变会组成性地激活KIT/RAS通路的下游效应物^[5,27]。KIT在生殖细胞瘤中有很高的突变频率，但在NGGCT中很少见。有研究报道，睾丸精原细胞瘤最常见的突变区域是位于第17外显子的TK2结构域和位于第11外显子的JM结构域^[28]。除了这些区域外，我们还发现了3例细胞外结构域的KIT突变，该突变在胃肠道间质瘤中发现，但在IGCT队列中未发现^[12]。这些结果表明KIT的胞外结构域突变也可能与IGCT有关。虽然生殖细胞瘤患者预后良好，但有10%的患者在多次治疗后复发^[1]。KIT抑制剂如伊马替尼和阿伐替尼可为KIT突变患者提供额外的治疗选择^[29]。RAS作为KIT最重要的下游效应物之一，在IGCT中突变率也高达17%。最近，临床开发的KRAS抑制剂sotorasib（AMG 510）的临床试验显示出优异的抗癌活性^[30]。虽然KRAS突变主要发生在NGGCT患者中（18%），但sotorasib可能会给这些患者带来一些临床益处。除了之前发现的KIT/RAS和AKT/mTOR信号通路^[12]外，我们的研究还发现，HIPPO、NOTCH、WNT等其他信号通路的体细胞突变也比较频繁，可以提供更多潜在的治疗靶点。此外，与生殖细胞瘤患者相比，NGGCT患者的MSI评分更高，表明其基因组不稳定性较高。因此，NGGCT患者可能对PARP抑制剂和其他DNA损伤剂更为敏感。当然，这些分子策略需要进一步的临床前和功能数据确认，然后在广泛的临床试验中进行测试。

我们的中国IGCT患者队列显示的突变谱与以前的研究报告有所不同。我们的队列中RELN和SYNE1的突变率高于日本的队列^[12]，这可能是由于这两项先前的研究首先从WES开始选择候选基因对剩余病例进行靶测序。通过这种方法，未被WES检测到的罕见突变将不包括在目标基因面板中。在另一个日本IGCT队列中报道的JMJD1C种系突变在我们的中国IGCT患者中未被检测到。尽管来自中国和日本队列样本的比较分析揭示了同一疾病突变景观的差异，但由于每种NGGCT亚型的不同比例在每次研究中可能不同，因此得出中国患者的CNS gct与日本患者不同的结论还为时过早。本研究为单中心研究，尽管患者来自中国不同的地理区域。未来，我们将考虑纳入其他医疗中心的患者，构建更全面的IGCT分子图谱，甚至NGGCT在中国的亚型，这将进一步丰富疾病的遗传背景，并有望为未来的临床试验提供必要的信息。

NF1是一种编码神经纤维蛋白1的蛋白编码基因，我们也发现NF1突变可能与IGCT患者PFS和OS缩短有关。有报道称，NF1在体内和体外均可作为RAS信号通路的负调控因子^[31]。nf1缺陷肿瘤表现出高水平的RAS-gtp，不受调节的细胞生长和增殖，这表明RAS信号通路的激活可能有助于其发展^[32,33]。我们的队列中NF1的突变率为6%，高于之前报道的3%^[12^]。发现NF1突变3例，其中1例为卵黄囊瘤，1例为成熟畸胎瘤，1例为混合性肿瘤（以未成熟畸胎瘤为主）。尽管由于疾病的罕见性，样本量很小，但这些结果表明NF1突变可能是IGCT患者，特别是NGGCT患者的预后不良标志物。

分泌性和非分泌性NGGCT患者的治疗方案差别很大，前者以化疗为主，后者以手术为主。我们发现非分泌组的VWF突变率高于分泌组。VWF编码一种参与止血的糖蛋白，其缺乏是大多数血管性血友病的病因^[34]。VWF在肺腺癌中高表达预示预后良好^[35]。一些拷贝数扩增的基因在非分泌组显著富集。这些基因可能与NGGCT对化疗药物的敏感性有关，可能为后期患者的精准治疗提供一定的价值。

克隆进化分析显示，最初诊断的肿瘤和复发的肿瘤具有相同的克隆，表明它们可能起源于共同的祖先，并且复发的克隆可以从复发前产生的亚克隆中衍生出来。在其他肿瘤中也发现了组织学转变。例如，一些肺腺癌在表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKI）治疗后会转化为小细胞肺癌（SCLC）。EGFR-TKI耐药SCLC克隆可以在组织形态改变之前的非常早期阶段从肺腺癌衍生出不同的进化过程^[36]。换句话说，在肿瘤转化之前已经产生了复发特异性克隆。虽然我们研究中两位患者的发现表明了早期分支进化模式，但小样本量并不排除其他进化轨迹的可能性。了解肿瘤克隆进化的模式，并从非常早期的肿瘤细胞主动操作，对于设计最佳治疗策略至关重要。

综上所述，我们在中国生殖细胞瘤和NGGCT患者中发现了一系列不同的体细胞突变、CNVs和细胞带。其中，NF1突变可能与IGCT患者预后不良有关。本研究有助于对IGCT特征的认识，并为进一步探索提供重要线索。

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作者简介

黄翔主治医师

复旦大学附属华山医院

复旦大学附属华山医院，神经外科，主治医师，医学博士。长期从事神经外科临床工作，对颅脑肿瘤（听神经瘤、胶质瘤、转移瘤、生殖细胞肿瘤、垂体瘤、颅咽管瘤、脑膜瘤等）和脑血管畸形(AVM)、椎管内肿瘤和先天性疾病（蛛网膜囊肿、Chiria畸形）等的显微外科手术有较丰富的诊治经验。曾赴美国UCLA附属医院及太平洋神经科学院、韩国亚洲大学医学院及CHA大学医学院交流学习，对颅内肿瘤的显微外科治疗有比较深刻的体会。

黄建涵博士

复旦大学附属华山医院

本科及硕士毕业于四川大学华西医院，目前为复旦大学附属华山医院外科学（神经外科）博士研究生。长期从事中枢神经系统肿瘤新型个体化治疗方案的研究。相关研究已在Signal Tranduction and Targeted Therapy、Cancer Immunology. Immunotherapy、Molecular Therapy: oncolytics、Histopathology等杂志以第一或共同第一作者获得发表。获上海市抗癌协会雏鹰计划A级资助项目1项，并先后参与国家重点研发计划1项、科技部“新药创制”重大专项2项。1项专利进入实质性审查阶段。

张超副主任医师

复旦大学附属华山医院

副主任医师，复旦大学附属华山医院神经外科，擅长成人和儿童常见神经外科疾病的诊疗，包括生殖细胞肿瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、蛛网膜囊肿和先天性畸形等的诊治。张超医生有较高的理论水平和较丰富的临床经验，想患者所想，耐心解答患者提出的问题，帮助很多患者摆脱了疾病地困扰。

丁兴华副主任医师

复旦大学附属华山医院

复旦大学附属华山医院神经外科副主任医师、副教授。擅长脑外伤后颅骨缺损和脑积水的手术治疗，脑膜瘤和胶质瘤的综合治疗，以及儿童脑肿瘤的微创手术治疗。

黄治成博士

复旦大学附属华山医院

现就读外科学(神经外科)学术型博士研究生，复旦大学附属华山医院神经外科，主要进行胶质瘤相关研究。曾赴台北荣民总医院、香港中文大学威尔斯亲王医院、复旦大学附属华山医院、乔治华盛顿大学附属医院、首都医科大学宣武医院的神经外科进行交流访问学习。

汪洋教授

复旦大学附属华山医院

华山医院肿瘤放疗中心副主任，党支部书记；华山医院东院射波刀中心主任医师；担任中国医师协会胶质瘤放疗专委会副主委、中国抗癌协会小儿神经肿瘤专委会副主委。1991年考入上海医科大学临床医学专业，1996年毕业并免试直升上海医科大学附属肿瘤医院肿瘤学专业研究生，1998年硕转博，2001年复旦大学肿瘤学专业博士研究生毕业，获医学博士学位。毕业后进入复旦大学附属华山医院工作。肿瘤学博士，擅长中枢神经肿瘤（胶质瘤、生殖细胞肿瘤、髓母细胞瘤、脑干肿瘤、垂体瘤和脑膜瘤等）的放疗和化疗，以及鼻咽、乳腺、食管、肺和骨软组织等肿瘤的诊断、放疗、射波刀、伽玛刀和化疗。2003年在美国哈佛大学医学院B.I.D.医院放疗中心进修。2004年晋升肿瘤治疗学副主任医师。2006年，获教育部科技进步一等奖(第四完成人)。2007年在美国参加射波刀技术培训。2016年在美国Thomas Jefferson大学医院进修。2016年晋升主任医师。2016年获上海市科技进步一等奖（第四完成人）。在国内外权威期刊发表论著三十余篇，7篇被SCI收录。获上海市科委和卫健委等科研基金多项。2009年获“优秀华山人”。

张荣教授

复旦大学附属华山医院

复旦大学附属华山医院神经外科教授，主任医师，医学博士

复旦大学附属华山医院宝山院区神经外科副主任，儿科中心副主任，小儿神经外科组长

中华医学会专业学组组长

国家神经疾病医学中心小儿神经外科联盟主席

国际小儿神经外科协会（ISPN）委员

中国医药教育协会小儿神经外科（互联网）副主任委员

上海市医学会小儿外科学会委员

上海市抗癌协会儿童肿瘤专业委员会副主任委员

上海医学会神经外科学会小儿神经外科学组副组长

中国医师协会小儿神经外科专家委员会委员

中国医师协会胶质瘤委员会生殖细胞肿瘤组副组长

中国医师协会胶质瘤专业委员会小儿组委员

长期从事神经外科临床工作，擅长小儿神经系统肿瘤和先天性畸形的诊断和治疗

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