【中国声音】丰育功教授团队揭示烟雾病全新免疫治疗靶点

2024年3月，青岛大学附属医院丰育功教授团队在《Scientific reports》发表题为“Identification of diagnostic markers for moyamoya disease by combining bulk RNA-sequencing analysis and machine learning”的研究论文。该研究首次将机器学习纳入烟雾病诊断标志物的鉴定，并发现了ACAN、FREM1、TOP2A和UCHL1作为烟雾病免疫治疗靶点的可行性，对烟雾病免疫治疗具有重要意义。本研究还勾勒出了烟雾病免疫微环境图谱，为未来烟雾病免疫微环境的研究提供了基础。青岛大学附属医院徐一凡博士为第一作者，丰育功教授为通讯作者。

烟雾病（MMD）是一种原因不明的慢性进行性脑血管疾病。越来越多的报告描述了与感染或自身免疫性疾病相关的烟雾病的发展。识别生物标志物对于理解该疾病的发生机制和开发新型靶向治疗至关重要，也可能改善患者预后。但由于发病机制的不确定，该病目前的主要治疗方法仍为血运重建手术治疗，尚无有效药物能够预防或减缓烟雾病的进展。如何早期发现和准确诊断烟雾病，找到早期检测的生物靶点并发现新的治疗靶点，从而改善患者预后成为相关学科研究的重要导向。

针对这一问题，丰育功教授团队在此分析了两个GEO数据库中基因表达数据，并通过加权基因共表达网络分析（WGCNA）和差异表达分析鉴定出266个关键基因。随后进行KEGG和GO分析以构建蛋白质相互作用（PPI）网络。采用支持向量机递归特征消除（SVM-RFE）、随机森林和最小绝对收缩选择算子（LASSO）三种机器学习算法对这些关键基因进行进一步分析，并根据所发现的4个核心基因（ACAN、FREM1、TOP2A和UCHL1）交叉构建MMD诊断模型，其AUC值依次为0.805、0.903、0.815、0.826，准确率较高。基因富集分析显示，在叶酸代谢、氨基酰-tRNA生物合成、脂肪消化吸收以及果糖和甘露鳖代谢等碳库途径上存在显著差异。此外，免疫浸润谱显示ACAN与肥大细胞静息有关，FREM1与T细胞CD4 naive有关，TOP2A与B细胞记忆有关，UCHL1与肥大细胞活化有关。最后，我们通过qPCR验证了这四个关键基因。

研究结果

DEG筛选和数据预处理

通过整合GSE157628和GSE141024队列的样本表达谱，我们进行了DEG筛选和数据预处理，研究了免疫相关基因在烟雾病进展中的作用。为验证校正前后样本分布的一致性，我们采用主成分分析法进行了验证。图S1A（略）展示了去除批效应前两个数据集的散点分布情况，而图S1B（略）则显示了校正后样本中混杂因素被成功去除。图2A、B呈现出所有样本的归一化和差异表达基因（DEGs）分析结果，其中行代表样本，列代表基因表达值。火山图清晰地展示出已识别到的DEGs，在其中83个基因上调、331个基因下调（见图2C）)。Ridgeline图揭示了烟雾病中各种生物功能和过程发生变化（见图2D）。此外，温度梯度也在图2E所示的热图中得以展现。

WGCNA功能模块筛选

我们对GSE157628和GSE141024数据集中的样本进行了聚类，并得到了一个包含7001个标准差大于零的基因表达矩阵。为了排除异常样本，我们设定了一个阈值（图3A）。另一种方法是利用“WGCNA”包中的“pickSoftThreshold”函数建立无标度网络，将功率参数范围设置为1-30，并将软阈值设置为6，如图3B、c所示。通过平均分层聚类和动态树切割法确定出8个模块（图3D）。图3E展示了临床特征与ME值之间的正面相关性。通过对模块内部转录相关性的分析证明了模块相互作用的可靠性，并表明各模块之间不存在实质性联系（图4A）。而独立性检验结果显示各模块之间也不存在相关性（图4B）。

功能富集分析

Venn图显示，DEG与WGCNA模块基因共有266个共同基因（见图4C, 补充表S5）。DO分析结果表明，这些常见基因与急性淋巴细胞白血病、眼动病、脑神经疾病和急性心肌梗死相关（见图5A）。应用GO分析探索了与烟雾病相关的信号通路，主要包括细胞组分（CC）、生物过程（BP）和分子功能（MF）三类。GO富集分析显示出266个与bp密切相关的常见基因，如心脏收缩、心脏过程；突触前、神经元细胞体等CCs；以及泛素结合和重复结构域结合等（见图5B）。同时值得注意的是，通过KEGG分析发现几种常见癌症如胃癌、乳腺癌和肝细胞癌也存在富集现象，这意味着可能存在相似或相同的分子机制来推进烟雾病和癌症进展。此外还发现了一些常见通路如Hippo、Wnt和ErbB信号通路等（见图5C-E）。同时，在PPI网络中建立了枢纽模块，其中包括关键的动脉粥样硬化斑块进展和免疫相关基因（见图5F, G）。p<0.05表示统计学上具有显著意义。

诊断标记基因的验证

我们采用机器学习算法选择最重要的特征来筛选具有诊断价值的枢纽基因。通过LASSO逻辑回归从差异表达基因中鉴定出13个关键生物标志物（图6A）。通过SVM-RFE算法获得58个基因作为诊断标记（图6B, C），RF算法确定30个基因作为关键指标（图6D, E）。通过对LASSO、随机森林和SVM-RFE筛选结果进行重叠分析，最终得到4个共享枢纽基因，分别是ACAN、FREM1、TOP2A和UCHL1，并被认为具有最大的诊断价值（图6F）。为进一步验证每个共享中心基因在诊断和预后方面的效果，我们使用ROC曲线和AUC值进行评估（图7A, B）。此外，在下载的两个数据集中验证了这四个基因在不同状态样本之间的表达差异，并观察到ACAN、FREM1、TOP2A和UCHL1在MMD样本中显著下调（图7C）。

ACAN、FREM1、TOP2A、UCHL1与免疫浸润的相关性分析

我们进行Spearman相关分析，进一步明确关键基因与各种免疫细胞亚群的相关性。结果显示，ACAN与肥大细胞静息呈正相关（p=0.066，认为有统计学意义）（图9A）。FRM1与T细胞滤泡辅助细胞呈正相关（p=0.045，r=0.52），与T细胞CD4 naive呈负相关（p=0.027，r=-0.57）（图9B、E、F），TOP2与B细胞记忆呈负相关（p=0.02，r=-0.59）（图9C、G）， UCHL1与T细胞CD4记忆激活（p=0.037，r=-0.54）和肥大细胞激活（p=0.012，r=-0.63）呈正相关（图9D、H、I）。肥大细胞似乎与烟雾病的诊断标记基因关系更密切，更有可能在烟雾病中发挥重要作用。基因相关性也被检查，如图10A、B所示。

免疫相关分析

为了进一步评估烟雾病和对照样本之间免疫细胞浸润和标志基因集的差异，采用CIBERSORT算法。差异免疫细胞浸润结果如图10C所示。与共享枢纽基因相关的免疫浸润通路的ssGSEA结果如图所示。ACAN与胆汁酸代谢呈正相关（图11A）。肌发生和Kras信号（DN）与FREM1呈强正相关（图11B）。E2F靶点、NOTCH信号、P53通路外源代谢均与TOP2A呈强负相关（图11C）。代谢、TGF β信号均与UCHL1呈强正相关（图11D）。这表明这些特征基因可能在烟雾病的发展过程中调控免疫过程。