脑海绵状血管畸形（cerebral cavernous malformations, CCMs）是一种主要发生在中枢神经系统颅内血管异常病变，在人群中的患病率约为0.16–0.5%，其特点是紧密聚集、异常扩张和渗漏的毛细血管和静脉。病理学上，这种病变由具有缺陷的紧密连接和局部抗凝分子失调的异常单层内皮组织构成。内皮组织中紧密连接的丧失和抗凝分子水平的升高可能导致自发性颅内出血（intracerebral hemorrhage, ICH），从而导致癫痫发作、头痛、局灶性神经功能缺陷或危及生命的出血性卒中。

根据患者是否存在CCMs阳性家族历史，CCMs患者被分为散发性（约占80-85%的病例）或家族性（约占15-20%的病例）。在磁共振（magnetic resonance imaging, MRI）上，家族性CCMs的多发病变可以分为两种类型：表现为急性或亚急性ICH病灶，以及多个含铁血黄素沉着为特征的点状病变。在散发性CCMs中，由于单个症状性ICH病变通常可以切除后进行基因研究，因此它的基因型-表型的相关性得到了很好的研究。然而，在家族性CCMs中，由于无法获得点状病变的手术样本，因此家族CCMs中多发病变的基因型、表型和发病机制仍然不清楚。

最近，首都医科大学附属北京天坛医院神经外科曹勇教授团队联合香港科技大学王吉光教授团队，在《Clinical and Translational Medicine》（IF：10.6）上发表了题为《Genotype-phenotype correlations in multiple lesions of familial cerebral cavernous malformations concerning phosphatidylinositol 3-kinase catalytic subunit alpha mutations》的研究论文。此项研究通过对家族性多发CCMs病灶临床自然观察、手术标本基因测序、体内体外实验，证明ICH病变和多发点状病变的基因型和自然史截然不同，这不仅将加强我们对家族性CCMs发病机制的理解，还将为两种亚型病变的差异化管理策略提供宝贵的见解。首都医科大学附属北京天坛医院神经外科曹勇教授和香港科技大学王吉光教授为本文的共同通讯作者，首都医科大学附属北京天坛医院神经外科王杰博士为本文的独立第一作者。

背景

方法

结果

家族性CCMs的主要影像学表现为脑内多发性病变。根据之前的研究，家族性多发性CCMs病变可分为两种类型：症状性ICH病变和多灶性点状病变（图1A）。既往研究表明，症状性ICH的病变易于发生复发性颅内出血事件。然而，与ICH病变相比，多发点状病变的自然史尚不清楚。从2008年到2021年，本研究连续纳入10例携带CCM基因生殖细胞突变的多病变家族性CCMs患者。纳入患者的平均年龄是28.3岁，其中50.0%（5/10）的患者是男性，50.0%（5/10）的患者有CCMs阳性家族史，40.0%（4/10）的患者以局灶功能障碍就诊，而60.0%（6/10）的患者以头痛就诊。10例患者中，有12个ICH病变（首次入院时切除了ICH病变）和505个点状病变（图1B）。在总随访时间为3230.7病变年中，11个病变（10例发生在ICH组，1例发生在点状病变组）发生了新的临床出血事件，随访时间中位数为69.7个月（范围24.4至170月），所有病变的年累积出血事件发生率为0.34（95%CI，0.19-0.61）每100病变年。如图1C所示，Kaplan-Meier生存分析显示ICH病变的症状性出血事件的年累积发生率（每100病变年22.0）明显高于点状病变的年累积发生率（每100病变年0.03）（log-rank检验，p<0.001）。图1D显示了ICH和点状病变的随访MRI的代表性图像，而在切除ICH病变后，剩余的多个点状病变仍然保持稳定（图1E）。我们的结果表明，通过长期随访，家族性CCM点状病变始终保持稳定，而ICH病变则表现出侵袭性病史。

图2. 家族性CCMs症状性ICH病灶和点状病灶的突变谱。A、结合WES和/或ddPCR分析，CCMs的18个亚组病变（3个点状病变和15个ICH病变）的基因突变的总结。B、ddPCR结果显示在13/18（72.2%）的CCMs标本中检测出突变，平均等位基因突变频率为2.53%（范围从0.57%到6.33%）。C、86.6%（13/15）的ICH病变携带了体细胞突变加CCM基因生殖细胞突变，而100%（3/3）的点状病变仅具有CCM基因生殖细胞突变（Fisher exact test, p=0.012）。

症状性ICH病变富集了生殖细胞CCM基因突变以及体细胞PIK3CA突变，而稳定的点状病变仅具有生殖系CCM基因突变，这暗示着两个亚组病变中有不同的分子机制。为了研究家族性CCMs中多发病变的基因型与表型的相关性，我们进行了体内和体外的分子机制探索。最近的研究表明PIK3CA突变可能与出血事件的风险较高有关，而另一项研究报道PIK3CA突变能够增强CCM模型小鼠的CCM形成。先前的研究表明PIK3CA增加功能突变导致PI3K活性的激活，增加HIF-1a及其下游VEGF的表达。高水平的血管生成因子VEGF可能通过ROCK2途径增加抗凝分子thrombomodulin（TM）的表达，而TM是血管内抗凝途径的关键分子，TM升高被认为与CCMs出血的关键原因。为了确认PI3K通路激活对内皮细胞的影响，基于先前的工作，在正常HUVECs中通过转染siRNA靶向PTEN来激活PI3K信号通路。与对照相比，我们观察到蛋白印迹中PTEN敲除HUVECs中磷酸化AKT水平升高，这证实了PI3K通路的激活。接下来，我们检查PI3K激活是否能够激活VEGF通路。我们发现敲除PTEN增加了VEGFA、磷酸化ROCK2和TM的表达。TM的表达被MK-2206（PI3K信号通路的抑制剂）和Fasudil（ROCK信号通路的抑制剂）逆转（图3A）。此外，我们还研究了PI3K通路激活对Krit1敲除内皮细胞的影响，这些细胞通过转染siRNA靶向Krit1来敲除Krit1。我们发现在Krit1敲除内皮细胞中，PI3K通路的激活也增加了磷酸化AKT、VEGFA、磷酸化ROCK2和TM的表达。TM的表达也被MK-2206和Fasudil逆转（图3A）。总的来说，这些结果揭示了PI3K信号通路的激活能够在在正常HUVECs和Krit1敲除的HUVECs中都促进了VEGF通路的激活。

然后，我们在Krit1敲除小鼠中验证PIK3CA突变的作用。正如先前的研究所报道的，我们对出生后第一天的Cdh5-CreERT2; Krit1^fl/fl小鼠胃内注射4-羟基他莫昔芬，诱导Krit1的血管内皮细胞特异性敲除小鼠（Krit1^iECKO）。在小鼠30日龄时，通过MRI观察到了位于小脑的CCM病变。然后，在60龄时，通过眶后静脉给Krit1^iECKO或Krit1^fl/fl小鼠注射AAV-control或AAV-PIK3CA^H1047R，90日龄时进行小鼠的脑MRI和组织学检查（图3B）。有趣的是，在MRI上，与AAV-control+Krit1^fl/fl, AAV-PIK3CA+Krit1^fl/fl和AAV-control+Krit1^iECKO组相比，我们在AAV-PIK3CA^H1047R+Krit1^iECKO组观察到了较大的亚急性ICH病变（图3C-D）。然后，我们通过HE染色比较了四组小鼠中CCM病变的数量和大小，90日龄时，AAV-PIK3CA+Krit1^iECKO组和AAV-control+Krit1^iECKO组的平均病变数量分别为98.2和44.5个（图3D）。此外，根据先前的研究，我们对不同大小的病变进行了数量统计，我们发现与AAV-control+Krit1^iECKO组相比，AAV-PIK3CA^H1047R+Krit1^iECKO组中有更多较大的病变（>10000um²）（45.0与11.0），这有显著差异（图3E）。为了验证AKT/VEGF信号通路的激活和TM的表达升高，我们进一步在四组小鼠的脑组织切片上进行了磷酸化AKT、VEGFA和TM的免疫荧光染色。在90日龄时，与AAV-PIK3CA^H1047R+Krit1^fl/fl或AAV-control+Krit1^iECKO组小鼠相比，AAV-PIK3CA^H1047R+Krit1^iECKO小鼠的脑血管内皮细胞中VEGFA和TM的表达水平明显升高（图3F）。总之，这些证据表明PIK3CA激活性突变促进VEGF信号通路的激活，促进了Krit1^iECKO CCM小鼠的亚急性出血病灶形成。

我们体内体外研究表明PI3K通路激活可增加VEGF分子表达，导致抗凝分子TM表达上升，诱导ICH病变。因此，我们设想VEGF抑制剂贝伐单抗能够抑制AAV-+Krit1^iECKO CCM模型小鼠的亚急性ICH病变。为了验证此猜想，60日龄的Krit1^iECKO CCM模型小鼠通过眶后静脉注射AAV-PIK3CA^H1047R，同时，该小鼠被随机分为实验组和安慰剂组，实验组小鼠通过尾静脉注射贝伐单抗，剂量为2mg/kg，安慰剂组通过尾静脉注射等体积PBS，每周两次，共三周，然后在小鼠90日龄时进行MRI和组织学检查（图4A）。令人惊讶的是，与安慰剂组小鼠相比，实验组小鼠MRI未见明显亚急性ICH病变（图4B-C）。此外，HE染色显示贝伐单抗治疗显著减少了AAV-PIK3CA^H1047R+Krit1^iECKO CCM模型小鼠CCM病变的数量，并预防了较大的病灶形成（图4D-F）。这些发现支持VEGF信号通路在家族性海绵状血管畸形发病机制中的关键作用，并确定了贝伐单抗可作为治疗CCM疾病的潜在有效药物。

结论

第一作者简介

王杰 博士

首都医科大学附属北京天坛医院

•首都医科大学附属北京天坛医院神经外科2021级博士研究生，师从曹勇教授

•从事蛛网膜下腔出血、颅内动脉瘤及脑血管畸形的临床基础研究

•近3年以第一作者在Clin Transl Med、Stroke Vasc Neurol、J Neurosurg、Ther Adv Neurol Disord发表5篇SCI论文，累计IF 29.9分，5年IF 32.0分

通讯作者简介

曹勇 教授

首都医科大学附属北京天坛医院

•神经外科主任医师、教授、博士生导师

•长期从事神经外科脑血管疾病诊疗工作，在脑血管疾病精准手术治疗、复合手术治疗复杂脑血管病、脑血管疾病精准医学基础研究等方面做出突出贡献：创建基于个体化脑功能保护的脑血管疾病精准外科治疗体系，保护大脑重要功能，预防严重并发症；建立显微外科手术与血管内介入治疗相融合的神外复合手术平台，创建复合手术治疗复杂性脑血管病的新模式，降低了复杂性脑血管疾病手术致残率和死亡率，达到国内领先、国际先进的治疗水平；在国际上率先开展脑血管外科疾病多组学基础研究，探索和发现脑血管疾病新的致病机制，为精准治疗脑血管病提供候选靶向药物

•目前兼任中国卒中学会复合介入神经外科分会主任委员、首都医科大学脑重大疾病研究院副院长

•先后承担国家“十三五”、“十四五”重点研发计划，国家自然科学基金等十余项科研课题。近五年，以最后通讯作者于Circulation Research、Neurology、AJHG、Angiogenesis等高水平期刊发表SCI论文30篇，封面论文2篇。获自主知识产权8项，临床转化3项

•2019年荣获人民日报社、人民网、健康时报主办第三届国之名医·优秀风范荣誉称号。以第一完成人获教育部2022年度高等学校科学研究优秀成果奖（科学技术）一等奖，入选北京市科委科技新星计划、北京市医管局登峰人才计划和北京学者

王吉光 教授

香港科技大学

•香港科技大学夏利萊夫人冠名副教授

•主要研究领域为计算与网络生物学、功能基因组学与癌症演化、人工智能数据整合与计算病理学。开发多套生物信息学软件，如NOA、SAVI2、TEDG、CELLO等，在脑胶质瘤中发现METex14突变、MGMT基因融合，在脑血管瘤中发现MEKK3-I441M突变、GJA4突变等

•曾获2019年度国家优秀青年基金（港澳）支持，荣获首届钟南山青年科技创新奖、哥伦比亚大学欧文研究所精准医学奖、香港科技大学工学院青年学者研究奖、香港科技大学理学院优秀研究奖、中国科学院院长奖学金特别奖、中国科学院优秀博士学位论文奖等