本文来源于公众号：神经影像石大夫
Abstract
Purpose：应用定量磁化率图（QSM）研究毛果芸香碱诱导大鼠癫痫持续状态后脑组织的病理变化。
Materials and Methods：在11.7T磁共振中从注射毛果芸香碱和年龄匹配的对照大鼠的离体脑中获得3D多回波梯度回波（GRE）数据。从获得的3D GRE幅度和相位数据分别计算R2*和定量磁化率图。将QSM和R2*图谱与同一大脑中的Perls（铁）和Alizarin-red-S（钙）染色进行比较，以研究磁化率对比的病理生理学基础。
Results：毛果芸香碱治疗的大鼠丘脑出现双侧对称性病变，表现为R2*图高信号。相比之下，定量磁化率图显示病变内的对比度不均匀，有明显的高信号（顺磁性）和低信号（抗磁性）区。与组织学评估的比较显示，丘脑核中铁和钙阳性颗粒的局部沉积分别对应于磁化率图中描绘的顺磁性和抗磁性区域。病灶在背景校正的相位图像和重建的磁化率图之间观察到明显的差异，表明相位图中铁和钙沉积的区分不可靠。多元线性回归显示，病变中铁和钙的磁化率值与测量的光密度（OD）之间存在显著相关性（R² = 0.42，P＜0.001），与铁的OD呈正相关，与钙的OD呈负相关。
Conclusion：与R2*或GRE相图像相比，QSM能以高灵敏度和更高的空间准确性检测和区分病理性铁和钙沉积，是诊断癫痫持续状态后丘脑病变的一种有前途的技术。
Introduction
癫痫可由急性脑损伤（如创伤性脑损伤、脑感染或中风）引起。此类急性损伤后的癫痫发生涉及大脑中尚未完全理解的弥漫性分子和细胞变化。毛果芸香碱或红藻氨酸诱导的癫痫持续状态（SE）的动物模型被广泛用于研究癫痫发生背后的大脑病理变化。在SE的红藻氨酸和毛果芸香碱模型中都有脑钙化的组织学报道。营养不良钙化或铁沉积是一系列神经系统疾病中观察到的脑损伤后遗症，与退化或坏死组织区域的异常矿物质积聚有关。尽管目前尚不清楚脑组织矿化的确切机制，细胞凋亡或坏死细胞死亡区域细胞内钙浓度的局部增加被认为是钙化的主要原因。此外，不同时间点的组织病理学证据表明，随着时间的推移，红藻氨酸诱导的SE引起大鼠脑内钙盐沉积的大小和浓度增加。因此，能够灵敏和特异性检测脑内矿物质沉积的成像技术可以提供区域组织损伤和癫痫发生进展的重要替代标志物。
目前，计算机断层扫描（CT）被广泛用于检测大脑中的钙化病变。然而，CT 提供的软组织对比度有限，而且，钙化或出血性病变在＜100 HU 的衰减水平下无法有效区分。磁共振成像（MRI）中基于梯度回波（GRE）信号相位的定量磁化率图（QSM）对组织分子组成变化的顺磁和反磁效应有不同的磁化率，因此可以潜在地提供更特异的标记物来探测大脑的病理变化。矿化病变在常规自旋回波T2或T1加权序列中产生非特异性信号强度，并在GRE幅度（T2*加权）图像中表现为低强度区域。后一种效应源于矿化组织的不均匀磁化率分布引起的磁场扰动和体素内自旋去相位，这反映在复值GRE信号的非局部相上。与大多数灰质组织的含水量相比，铁蛋白和含铁血黄素等铁复合物是顺磁性的，而钙化合物如磷酸钙是抗磁性的。
先前的研究表明，使用磁敏感加权成像（SWI）生成的测量GRE信号相位和相关对比度对脑组织钙化的敏感性。QSM解决了不适定的场-源反转问题，已用于检测正常大脑和神经系统疾病中的钙化、微出血和非血红素铁。最近，QSM在区分出血和钙化方面的潜力得到了证实。在之前的人脑研究中，CT已被广泛用作比较钙化描绘的参考标准。然而，由于CT检测低浓度钙化、微出血和慢性出血的灵敏度有限，同时评估铁和钙化沉积物及其对QSM对比度的影响是不可行的。
在癫痫和创伤性脑损伤的实验模型中，通常在疾病的慢性阶段检测到成形良好的钙化。组织学研究表明，在早期阶段，钙盐可能以小颗粒和弥漫颗粒的形式存在。此外，据报道，大脑病变中铁的积累往往先于钙和其他矿物质沉积。因此，准确表征和鉴定这些病变的空间分布和组成，可以为SE诱导的癫痫损伤的进展和区域病理变化提供关键见解。
在这项研究中，我们开始使用基于11.7T高分辨率3D GRE成像的QSM来研究毛果芸香碱诱导SE后大鼠大脑的病理变化，并进一步通过与同一大脑中铁和钙特异性组织学染色的比较来破译SE后大脑病变的磁化率变化的病理相关性。
Materials and Methods
Animals and Pilocarpine-Induced SE
雄性Wistar大鼠（n = 10，10周龄，300-350 g）诱导SE。大鼠皮下注射东莨菪碱（2 mg/kg）以减少毛果芸香碱的外周不良反应。30分钟后，通过腹腔内注射毛果芸香碱（320 mg/kg）。视觉观察SE的发展3小时。最后，地西泮（10 mg/kg）腹腔内给药以降低死亡率。SE造模成功率为80%，死亡率为37%。在观察期内出现复发性全身性癫痫发作至少持续30分钟，并在SE诱导后存活3周的大鼠（n = 5） 被纳入研究。年龄匹配的对照大鼠（n = 5） 但用0.9%盐水溶液代替毛果芸香碱注射。SE诱导后3周，注射毛果芸香碱和年龄匹配的对照大鼠经心灌注0.9%生理盐水，然后在0.1M磷酸盐缓冲液(30ml/min;48C)中加入4%多聚甲醛(PFA)进行灌注。将大脑从头骨中取出，并浸入4%PFA中固定。
Data Acquisition
MRI在垂直孔11.7T NMR谱仪上进行，其配备有主动屏蔽Micro2.5梯度系统（最大梯度强度 = 1000mT/m）。直径为20mm的鸟笼线圈用于射频传输和信号接收。在MRI之前，将大脑转移到磷酸盐缓冲盐水（PBS）中48小时，然后放置在直径为20mm的玻璃管中，玻璃管中填充福尔马林，以防止组织脱水并最大限度地减少样本表面附近的磁敏感畸变。大脑的前后轴与外部磁场对齐。采集前，使用MAPshim程序进行基于场图的一阶和二阶匀场，以优化脑体积上的B0场均匀性。大脑的3D GRE数据是使用双极多回波梯度召回回波（MGE）序列采集的，具有以下成像参数：number of echoes = 8, first echo time (TE1) = 5 msec, interecho interval (ΔTE) = 5 msec, flip angle 45°,repetition time (TR) = 100 msec, 2 averages, and receiver bandwidth = 70 kHz. The field-of-view (FOV) and matrix size were 16 × 15.4 × 11.6 mm³ and 132 × 128 × 96, respectively, for a native isotropic resolution of 120 3 120 3 120 μm³. 总采集时间为～40分钟。在扫描过程中，通过与谱仪集成的恒温控制气流将样品的温度保持在36°C。
Data Reconstruction and Analysis
GRE幅度和相位图像是使用IDL6.4中的内部编写代码从3D k-空间数据重建的。在傅立叶变换之前，通过对称的10%梯形函数对复杂的k-空间数据进行变迹，并通过因子2对其进行零填充。R2*映射是通过奇数多回波GRE幅度数据与TE的体素水平单指数拟合来计算的。在15ms的TE下收集的相位数据用于生成高信噪比（SNR）和病变区域最佳对比度的频率和定量磁化率图。相位图首先使用基于3D拉普拉斯展开算法进行解联络，并使用复杂的谐波伪影减少对在MatLab中实现的具有可变核大小（V-SHARP）的相位数据进行空间滤波（奇异值分解阈值 = 0.05，最大核半径 = 13个体素）来去除背景场。使用Li等人描述的快速QSM方法的改进迭代版本重建定量磁化率图，该方法基于阈值大于2/3的k-空间划分（TKD）方法和奇异锥表面周围的k-空间滤波。使用基于点扩散函数的方法估计了用于校正可能低估定量磁化率值的比例因子。快速QSM方法已被证明在抑制截断相关条纹伪影方面具有良好的性能，但是估计的磁化率图可能具有残余的非局部偶极效应。因此进行了修改，以迭代的方式拟合MR相位/场的变化，直到残余场最小，然后以类似于Wei等人最近开发的QSM方法的方式叠加拟合的磁化率源。我们将该方法称为迭代TKD（iTKD）方法，并且在本研究中将误差容限设置为0.02。iTKD算法和所有经验参数的详细信息可在Appendix 中找到。
在五个连续的冠状切片上，使用RoiEditor在每只大鼠的皮层灰质（GM）中定义了一个双侧区域（中心距离前囟0.3 mm）。QSM图参考了在该区域测量的每只大鼠的平均磁化率值。皮层GM被用作QSM的参考，因为它在毛果芸香碱治疗的大鼠中没有显示出病理学诱导的变化，这通过组织学评估得到了验证。在该模型中，存在脉络丛钙沉积和脱髓鞘，因此无法使用脑室脑脊液（CSF）和白质作为QSM的可靠参考。为了进行分析，使用Diffeomap中实现的6参数刚体配准，将所有大脑图像与一个对照大鼠大脑对齐，作为解剖参考。配准过程由GRE幅度图像的信号强度驱动，并应用由此产生的变换来对齐每只大鼠的磁化率和R2*图。
由一名阅片者对磁化率和R2*图进行主观定性评估。丘脑病变是基于R2*和磁化率图中的强度相对于对照脑中相应区域强度来识别的。手动绘制34个感兴趣区（ROI），包括毛果芸香碱治疗大鼠丘脑的病变和非病变区域。使用RoiEditor在QSM重建图像的冠状切片中定义ROI，平均大小为118 ± 31个体素（平均值 ± SD）。通过将体素磁化率值相加除以ROI体积来计算每个ROI中的平均磁化率值。如下所述，在Perls和Alizarin染色的组织学切片中，在相同的冠状水平上确定了相应的ROI，用于光密度（OD）测量。
Histological Processing
MRI后，将大脑置于含有20%甘油的0.02M 磷酸钾缓冲盐水（KPBS；pH 7.4）冷冻保护溶液中36小时，然后在干冰中冷冻，并在−70°C下储存，直至切割。使用滑动切片机将大脑切片为30μm厚的冠状切片（1:5系列）。第一系列切片在室温下储存在10%福尔马林中，其余系列保存在冷冻保护剂组织收集溶液中（30%乙二醇，25%甘油，0.05 M 磷酸钠缓冲液），直至处理。从一个系列中，用茜素红S对1/2切片进行染色，以检测组织中钙的积聚。切片安装在明胶涂层的载玻片上，并在37°C下干燥。然后将切片在递减系列的乙醇中水合，在蒸馏水中漂洗，并浸入2%茜素红S（w/v，蒸馏水pH 4.1–4.3）45 秒。切片用丙酮、丙酮：二甲苯（1:1）和二甲苯快速脱水，然后安装在DePeX中。为了评估铁的沉积，使用Perls法用3,3′-二氨基联苯胺（DAB）强化对该系列的1/2连续切片进行染色。首先，用2.5%亚铁氰化钾和2.5%HCl的1:1混合物在37°C下处理安装的切片2小时，然后在PBS中洗涤三次，每次10分钟。接下来，将切片在0.5 mg/ml DAB孵化30分钟，然后浸入0.5 mg/ml DAB和0.01%H2O2混合液在黑暗中保持30分钟。最后，将切片在PBS中洗涤三次，每次10分钟，脱水，在二甲苯中清除，并用DePeX盖上。组织学图像由独立读者进行主观评估。与对照大鼠大脑切片相比，具有铁或钙沉积物的损伤组织区域被确认为在Perls或Alizarin红S染色切片中分别显示阳性染色的区域。
OD Measurements
使用ImageJ软件对选定丘脑区域的Perls和Alizarin红S染色切片的OD进行量化。使用配备AxioCam HRc相机的Zeiss AxioImager M2显微镜从每个染色切片中捕获数字显微照片。在将显微照片转换为灰度后，我们从与MR图像相同的冠状水平上的选定丘脑核的每个ROI（IROI）中获得强度值。背景染色强度值（IBackground）以圆形ROI（71μm²，放置在每张显微照片中没有染色的三个区域）进行测量，以补偿切片之间的任何染色差异。每个ROI的OD值通过将每个ROI的测量OD标准化为背景强度值来提取（OD = （IBackground−IROI）/IBackground）。
Quantitative Analysis
多元线性回归用于评估参考皮质GM（Δχ）的平均磁化率测量值与ROI中铁和钙的光密度之间的相关性，并使用F检验评估显著性，P<0.01被认为具有统计学意义。除了丘脑ROI外，在大脑的主要灰质和白质结构中也发现了感兴趣的体积，用于比较对照组和毛果芸香碱治疗的动物组之间的定量磁化率值。所有统计测试均使用MatLab进行。
Results
Detection of Thalamic Lesions With Heterogeneous Susceptibility Contrast
Fig.1显示了代表性对照和毛果芸香碱治疗大鼠的GRE幅度、R2*和定量磁化率图。R2*显示，毛果芸香碱治疗的大鼠丘脑中有明显的双侧病变，可识别为与对照脑中的相应区域相比出现显著（P<0.001）高信号的区域。这些高信号R2*区域是双侧对称的，并且在毛果芸香碱治疗的大鼠的丘脑的背侧和内侧区域中观察到（Fig. 1中的R2*图）。相比之下，相同水平的定量磁化率图显示病变内的对比度明显更不均匀（Fig.1）。与对照脑中的相应区域相比，发现病变内的不同区域表现出显著（P＜0.005）的阳性（顺磁性）或阴性（抗磁性）磁化率值。相对于皮质GM，在Fig.1所示的顺磁性和抗磁性病变区域测量的代表性磁化率值为0.056 ± 0.017 ppm和−0.031 ± 0.012 ppm，分别（平均值 ± SD，Fig.1中所勾画QSM高信号区和低信号区）。V-SHARP滤波的GRE相位/频率图和重建的同一水平的磁化率图的比较显示，病变的对比度存在显著差异（Fig.2）。在相位图和磁化率图中，可以观察到病变区域的高强度和低强度外观之间的局部对应性较差（Fig.2，箭头）。
Fig.1: Bilaterally symmetric lesions in the thalamus of pilocarpine-treated rats delineated with GRE imaging. Coronal GRE magnitude (TE = 15 msec), R2*, and quantitative susceptibility maps from a control rat (top row) and two representative pilocarpinetreated rats (middle, bottom rows) are shown. Bilateral thalamic lesions can be identified as hyperintense areas in the R2* maps. Magnified views of QSM images in the right panel (corresponding to regions indicated by the white boxes) demonstrate distinct diamagnetic (blue arrows) and paramagnetic (orange arrows) areas delineated in the thalamic lesions. Scale bar = 1.5 mm.
Fig. 2: Comparison of GRE frequency and quantitative susceptibility contrasts in thalamic lesions. A coronal slice from a representative pilocarpine-treated rat brain at the level of thalamic lesions shows the raw GRE phase, unwrapped phase, V-SHARP-filtered frequency, and quantitative susceptibility maps. Arrows indicate localized differences in hypointense and hyperintense appearance of lesion areas seen in the frequency and susceptibility maps.
Fig.3将对照和毛果芸香碱处理的大鼠的R2*和磁化率图与来自相同大脑的Perls和Alizarin红S染色切片进行了比较。对照大鼠的丘脑铁和钙均呈阴性染色（Fig. 3c,d）。相比之下，毛果芸香碱治疗大鼠的切片显示，在丘脑的特定背侧和内侧，铁和钙阳性颗粒的局部沉积（Fig.3g，h），这与QSM图像中描绘的顺磁性和抗磁性区域密切对应（Fig.3f）。在铁和钙沉积物共定位的区域（Fig.3g″–h″），在QSM图像中观察到相对正的对比度，表明由铁浓度主导的局部磁化率偏移。Fig. 3h′–h″中所示的选定丘脑区域的高倍视图描绘了弥漫微观颗粒形式的钙沉积物，只有少数小晶体形成（Fig.3h″中箭头所示）。
Fig. 3: Comparison of R2* and quantitative susceptibility maps through the thalamus of control (a,b) and pilocarpine-treated (e,f) rats with coronal Perls’ (iron) and Alizarin red S (calcium)-stained sections from the same brains. Localized deposits of iron and calcium are seen in the pilocarpine-treated rat brain (g,h), which correspond closely to the paramagnetic and diamagnetic regions delineated in the susceptibility map (f). High-magnification views in panels g0–h0 and g00–h00 (corresponding to areas within the black boxes in g,h) reveal microscopic granular iron and calcium deposits in select thalamic areas, with a few formed calcified crystals (black arrowheads). Scale bars for a–h = 1 mm; for g′–h″ = 200 μm.
毛果芸香碱治疗的大鼠在丘脑前部水平的代表性R2*和定量磁化率图如Fig.4所示。在R2*图中可以在丘脑前部描绘双侧和对称的高信号病变（Fig.4b，e），在QSM图像中，不同的病变区域表现为相对抗磁性和顺磁性（Fig.4c，f中的箭头）。丘脑前部的Perls和Alizarin红S染色显示，在同一丘脑区域有非常细的铁和钙沉积（Fig.5）。在Fig.5中，可以观察到由Perls染色揭示的区域性铁沉积与QSM图像中病变周围的顺磁性区域之间以及弥漫性钙沉积与QSM图像中相对抗磁性区域之间的密切对应。相比之下，这些区域在R2*图中无法有效区分（Fig.5b）。
Fig. 4: Delineation of bilateral lesions in the anterior thalamus of pilocarpine-injected rats. Coronal GRE magnitude (a,d), R2* (b,e), and quantitative susceptibility (c,f) maps from two representative pilocarpine-treated rat brains at the level of the anterior thalamus are shown in the top and bottom rows, respectively. Thalamic lesions can be identified as bilateral hypointense and hyperintense areas in the magnitude and R2* images, respectively. QSM images (c,f) show heterogeneous contrast within the thalamic lesions, with relatively diamagnetic (blue arrows) and paramagnetic (orange arrows) appearance of distinct lesion areas.
Fig.5: Comparison of susceptibility and R2* maps with histological Perls'- and Alizarin red S-stained sections from the anterior thalamus of a pilocarpine-treated rat. a,b: Coronal slice from quantitative susceptibility (a) and R2* (b) maps. c,d: Perls'- and Alizarin red S-stained sections from the same brain show regional deposition of iron and calcium in corresponding thalamic areas. e–h: High-magnification views of histological sections (corresponding to regions indicated by the black boxes in c,d) demonstrate diffuse granular deposits of iron and calcium observed in the tissue. Scale bars for c,d = 1 mm; for e–h = 200 μm.
Fig.6显示了经毛果芸香碱治疗的大鼠的QSM和R2*图与来Paxinos和Watson从大鼠大脑图谱中获得的冠状面的比较。发现双侧对称的病变区域沿着大脑前后轴紧密遵循特定丘脑核的解剖边界。与R2*和QSM图像中确定的病变区域相对应的主要丘脑核团包括丘脑后核团、外侧后核、外侧膝状体核和椭圆中央旁核（Fig.6）。
Fig.6: Nuclei-specificity of thalamic lesions in the rat brain with pilocarpine-induced SE. QSM (a,d) and R2* (b,e) maps at two different coronal levels are compared with corresponding sections from the rat brain atlas (c,f) by Paxinos and Watson.Major thalamic nuclei corresponding to the lesioned areas include: the lateral posterior nucleus (blue), dorsal lateral geniculate nucleus (green), posterior thalamic nuclear group (red), and the oval paracentral nucleus (purple).
Quantitative Analysis
多元回归分析表明，丘脑病变中铁和钙的定量磁化率值与组织学测量的光密度之间存在显著关系（Δχ = −0.006 + 0.58[ODiron]−0.26[ODcalcium]，R² = 0.42，P<0.001）。铁的OD拟合回归系数为正（P<0.001），而钙的OD回归系数为负（P = 0.006），表明QSM区分病变中局部铁和钙沉积的特异性。回归分析的结果如Fig.7所示。
Fig.7: Plot showing results of multiple regression analysis between susceptibility values (Δχ, referenced to cortical gray matter) and optical densities of iron and calcium in the thalamic lesions as measured from Perls'- and Alizarin red S-stained sections, respectively.
Table 1列出了在对照组和毛果芸香碱治疗组的主要灰质和白质结构中测量的平均磁化率值。对照组和毛果芸香碱处理组大鼠皮层和纹状体的磁化率无显著差异（P = 0.29和0.79），以及包括视束、胼胝体和前连合的白质束（P = 分别为0.76,0.12和0.11）。
Discussion
在本研究中，我们证明了在11.7T下使用基于3D各向同性高分辨率GRE成像的QSM检测毛果芸香碱诱导的SE大鼠特定丘脑核中的病理性铁和钙沉积。与R2*和GRE相位图像相比，定量磁化率图提供了高空间精度，能够检测和区分铁和钙的局部沉积，通过对相同大脑的组织学评估进行验证。值得注意的是，这项研究的结果显示，在丘脑中检测到以弥漫性和小颗粒形式存在的早期无定形钙盐沉积，这与在疾病后期观察到的完全成形的钙化不同。这些发现证明了QSM检测SE后组织成分细微病理变化的潜力，并表明QSM可能为SE后丘脑病变的诊断和表征提供一种有前途的技术。
在检测大脑中病理性和与年龄相关的铁沉积的研究中，R2*与定量磁化率值之间存在线性相关性。然而，在具有不同程度钙化的病理性脑病灶中，R2*与磁化率没有表现出线性或单调关系。在毛果芸香碱治疗的大鼠中，R2*图对含铁和含钙的病变区域都表现出高信号，并且没有提供区分这些沉积物或提供有关病变组成的信息的辨别能力。由于R2*反映了净体素内自旋去相位的影响，它对由场扰动的顺磁性或抗磁性源引起的去相位不提供差别灵敏度。反过来，定量磁化率图显示病变对比度与组织学切片中观察到的组织变化更为一致。此外，定量分析显示，磁化率测量对Perls染色（铁）的OD有显著的正依赖性，对Alizarin红S染色（钙）的OD则有显著的负依赖性。这些发现表明，QSM可以在SE后丘脑病变的分类中提供更高的空间准确性和更大的诊断价值。
脑实质中的钙盐沉积物由羟基磷灰石形式的磷酸钙组成，据报道其磁化率为−14.83ppm， 使得其相对于水具有轻微的抗磁性。在我们的实验时间点，钙沉积物以弥漫的微观颗粒的形式被发现，只有少数小的晶体形成。这些弥漫性颗粒沉积物不同于在疾病晚期观察到的完全成形的钙化。研究已经证明，颗粒沉积物的大小和浓度随着时间的推移而增加，形成钙化聚集体，这可能是病变成熟度的指标，因此也是从最初损伤开始的时间的指标。我们的数据证明了QSM对检测这些早期弥漫性钙沉积的敏感性，这可能为检测丘脑病变的进行性钙化提供有用的替代标记物。
与脑出血中报告的局部和浓缩铁沉积相反，毛果芸香碱治疗的大鼠中的丘脑铁沉积与磁化率图中检测到的高信号病变区域相对应，在Perls染色切片中以精细和弥漫性沉积的形式观察到。我们假设SE后丘脑中铁的病理性沉积可能来源于两个方面；首先是血脑屏障（BBB）的破坏，其次是伴随小胶质细胞/巨噬细胞活化的生理铁。在人类癫痫和SE动物模型中都有血脑屏障渗漏的报道。在空间上，最近一项研究中报道的BBB通透性似乎也与我们研究中观察到的双侧丘脑病变的位置和程度重叠。铁沉积的第二个来源可能来自铁阳性小胶质细胞/巨噬细胞，它们含有含铁血黄素形式的铁，也被认为有助于钙化过程。本研究中的铁积聚与Nissl染色切片评估的局部胶质增生区域相吻合，进一步支持了胶质细胞活化可能有助于铁沉积以及在磁化率图中观察到的顺磁对比的观点。然而，要弄清楚毛果芸香碱诱导SE后磁化率图中对顺磁对比有贡献的铁是全身铁还是大脑铁，或者两者兼有，需要进一步研究。
我们的数据还证明了在解释GRE相位或频率对比度以表征脑组织损伤方面的注意事项。GRE相位成像和SWI已被证明有助于区分颅内钙化和出血。在本研究中，发现背景校正相位图和重建的磁化率图在丘脑病变区域显示出显著的对比度差异。这些发现与最近在人脑中的报告一致。此外，MRI数据与Perls和Alizarin红S染色的比较表明，与QSM相比，相位图不能可靠地区分局部铁和钙沉积的区域。这些结果可以归因于GRE信号相位的已知非局部属性（the known nonlocal nature of the GRE signal phase）。测量的相位反映了潜在磁化率分布的非局部卷积，因此受到成像体素外部扰动的影响。此外，GRE信号相位取决于采集参数（特别是TE）、病变形状和相对于主磁场的方向，相位图中的对比度也可能受到应用的空间滤波方法的影响。因此，需要谨慎解释相位图中病变的对比度，并且可能导致顺磁性区域和抗磁性区域的错误分类。
在本研究中检查的实验时间点，在几个丘脑病变中观察到铁和钙沉积的共定位，尽管钙沉积延伸到没有沉积聚的区域。这与之前的报告一致，之前的报告描述了铁的积累往往先于钙和其他矿物质在大脑病变中的沉积。在铁和钙共存的区域，磁化率图显示出高信号，这可归因于铁诱导的主要顺磁磁化率位移。有必要进行进一步的纵向研究，以评估损伤后伴随进行性钙化和病变成熟度的磁化率变化以及顺磁和抗磁病变区域的空间分布。
在我们的研究中，毛果芸香碱治疗组在可重复的丘脑区域的R2*和磁化率图中检测到双侧和对称病变。关于丘脑核在SE后癫痫发生中的作用，文献中的数据有限。以前对癫痫患者的一些研究也报道了丘脑中的T2加权高信号病变，主要发生在丘脑枕。据我们所知，这是第一项表明毛果芸香碱诱导的SE后大鼠大脑中的丘脑病变是核特异性的研究，并且与跨动物的特定丘脑核的解剖边界紧密对应。虽然在我们的研究中观察到的病变的核团特异性的病理机制尚不清楚，但这可能表明这些丘脑核团选择性参与毛果芸香碱诱导的SE后的癫痫发生。
在毛果芸香碱治疗的大鼠和对照大鼠之间，我们没有观察到不同灰质和白质解剖结构中Δχ的显著变化，尽管毛果芸香碱治疗组在检查的主要白质束中的平均磁化率值略低。虽然我们的结果表明，在SE的毛果芸香碱模型中，这些结构的磁化率没有显著的病理学诱导的变化，但我们研究中相对较小的样本量和受试者间的差异也可能影响检测由于潜在的白质病理学引起的磁化率差异的统计组间比较的敏感性。
也有必要注意这项研究的局限性。虽然我们的研究表明，病变中的Δχ测量值与铁和钙特异性染色的光密度之间存在显著相关性，但导致病理病变磁化率变化的来源是多种多样的，包括髓鞘、脱髓鞘和微量元素（如铜、锌等）的存在，这些因素也发挥顺磁/抗磁作用。丘脑的磁化率对比可能受到髓鞘含量的影响。然而，由于有髓鞘纤维和白质微观结构对测量的磁化率的TE依赖性和各向异性影响，与髓鞘染色的组织学相关性并不直接。此外，病变中的局灶性矿化可伴有不同程度的脱髓鞘，因此与病理性铁和钙积聚的影响相比，髓鞘对丘脑灰质核中QSM对比的贡献预计较弱。还需要注意的是，我们研究中的回归分析是对组织学Perls和Alizarin红S染色的OD进行测量的。评估绝对铁和钙浓度的标准不容易用于分析Perls和Alizarin红S染色材料，因此只能测量病变中铁和钙沉积的相对量。未来使用质谱法的研究可能能够更有力地量化病变中的铁和钙浓度，并将其与QSM对比进行比较。
在本研究中，iTKD方法被应用于QSM重建，而不使用正则化或先验约束，以最好地保留丘脑小病变周围的对比度以及大鼠大脑中的解剖结构，同时实现条纹伪影的最小化。然而，当前的QSM技术仍有一些已知的局限性，重建的磁化率图可能会受到残余背景场贡献和混杂伪影的影响，特别是在血管附近的体素和组织-空气界面附近的区域。更复杂的QSM重建方法的进一步技术进步可以提高致痫脑中病变检测和描绘的准确性。
总之，本研究的结果表明，与R2*或GRE相位成像相比，QSM可以以高灵敏度和更高的空间准确性检测和区分病理性丘脑核特异性铁和钙沉积。因此，在实验模型和临床中，QSM可能成为研究SE后丘脑病变组织成分局部变化和进行性钙化的重要技术。
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