近期，新疆医科大学第一附属医院神经外科中心汪永新教授研究团队在综合性期刊《SCI REP-UK》发表了题为《A preliminary study on the mechanism of VASH2 in childhood medulloblastoma》的研究论文。本研究首次发现VASH2的阳性表达率与SHH型儿童髓母细胞瘤密切相关，VASH2通过影响TGF-β通路，参与了SHH髓母细胞瘤细胞系DAOY的侵袭、迁移、细胞周期等过程，并显著影响了DAOY细胞凋亡指标的表达，VASH2有望成为SHH型儿童髓母细胞瘤的诊断和治疗靶点。
Liu, W., Fu, Y., Wang, M. et al. A preliminary study on the mechanism of VASH2 in childhood medulloblastoma. Sci Rep 13, 17153 (2023).https://doi.org/10.1038/s41598-023-42869-6
摘要
为研究血管抑制素2（VASH2）在不同分子亚型儿童髓母细胞瘤（MB）肿瘤组织中的表达差异，分析VASH2与髓母细胞瘤分子亚型、临床病理资料及预后的相关性，探讨VASH2在SHH髓母细胞瘤细胞系DAOY中作用的具体机制。我们分析了2011年1月至2019年12月新疆医科大学第一附属医院儿童神经外科收治的47例儿童髓母细胞瘤病例，通过免疫组化（IHC）检测了这些肿瘤组织中YAP1和GAB1的表达水平，并进行了分子分型（WNT型、SHH型和非WNT/SHH型）。我们分析了VASH2与髓母细胞瘤分子分型之间的相关性。还分析了GEO数据库中的髓母细胞瘤数据集（GSE30074和GSE202043），探讨了VASH2与髓母细胞瘤患者预后的相关性，并专门针对VASH2基因进行了全面的GO富集分析，以揭示其复杂分子谱的潜在生物学通路。我们以血管抑制素2（VASH2）为研究靶点，通过慢病毒载体分别在SHH髓母细胞瘤细胞系DAOY中建立体外过表达和敲降VASH2，研究其在SHH髓母细胞瘤细胞系DAOY细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭和细胞周期中的生物学作用。（1）在47例儿童髓母细胞瘤病例中，8例为WNT型，29例为SHH型，10例为非WNT/SHH型。VASH2的阳性率在SHH型中最高，为68.97%，其次为非WNT/SHH型，WNT型最低。多因素分析结果显示，VASH2的阳性表达与髓母细胞瘤分子亚型（SHH型）、肿瘤发生部位（四脑室）和性别（男性）有关，P＜0.05。（2）细胞实验结果表明，过表达VASH2可增加SHH髓母细胞系Daoy的侵袭和迁移能力，而敲降VASH2则可抑制其侵袭和迁移，过表达VASH2可上调Smad2+3、Smad4、Mmp2以及凋亡指标Bcl-2和Caspase3的表达，而敲降VASH2则抑制了Smad2+3和Mmp2的表达，敲降了Smad4以及凋亡指标Bcl2和Caspase3的表达。流式细胞周期分析表明，VASH2过表达增加了Daoy细胞周期的S期，而VASH2敲降则降低了SHH髓母细胞瘤细胞系DAOY细胞周期的S期。生物信息学分析表明，GSE30074和GSE202043数据集中VASH2基因的表达与患者的预后无统计学差异，但该数据集的分析结果提示我们今后需要继续扩大研究样本量。GO富集分析结果表明，血管生成通路的富集程度最高，VASH2的PPI相互作用网络来自STRING数据库。利用STRING数据库，我们得到了VASH2的PPI相互作用网络，对VASH2相关基因的KEGG富集分析表明，VASH2相关基因与细胞凋亡通路有关，因此推断VASH2也通过细胞凋亡影响肿瘤的发生发展。我们首次发现，VASH2的阳性表达率与SHH型儿童髓母细胞瘤密切相关，VASH2通过影响TGF-β通路的下游指标，参与了SHH型髓母细胞瘤细胞株DAOY的侵袭、迁移、细胞周期和凋亡能力。上述结果均提示它参与了儿童髓母细胞瘤的进展，VASH2有望成为SHH型儿童髓母细胞瘤的诊断和治疗靶点。
正文
髓母细胞瘤（MB）是儿童中枢神经系统最常见、最恶性的肿瘤之一。髓母细胞瘤的长期治疗仍然是一个巨大的挑战，目前临床研究的重点是靶向治疗和免疫治疗。这些新型疗法也逐渐应用于临床治疗中，但与其他实体瘤的治疗效果相比，髓母细胞瘤患儿的预后仍然较差，要提高髓母细胞瘤患儿的生存率和生活质量，还有很长的路要走。这表明，儿童MB侵袭性复发发展的机制较为复杂，儿童MB患者仍缺乏客观的预后评估指标和有效的治疗靶点。因此，对其复发机制的研究十分必要，对其机制的探索可为开发新的治疗靶点提供思路。
2021年，WHO（World Health Organization）将髓母细胞瘤分为四种分子亚型：WNT型、SHH-TP53野生型、SHH-TP53突变型和非WNT/SHH型。其中，之前的第3组和第4组类型此次被归为非WNT/SHH型。目前，根据这四种分子分型对MB进行个体化治疗的临床指南使我们能够进一步提高儿童MB的诊断水平。大多数儿童MB确诊后，临床医生一般会根据术后病理结果采取手术切除和选择性放化疗相结合的治疗方法，但总体疗效仍不理想。
儿童MB的进展机制是多种因素共同作用的结果，肿瘤的侵袭性复发通常是疾病进展过程中某些信号通路异常激活的结果。因此，研究参与儿童MB复发进展的基因并阐明其作用机制，为儿童MB的临床治疗寻找特异性靶向药物和预后分子标志物具有重要意义。我们对最新研究结果的分析发现，肿瘤复发与肿瘤细胞增殖、侵袭和凋亡等生物学过程有关，也与疾病的治疗和预后评估密切相关。重要的是，肿瘤治疗效果不佳的主要原因是肿瘤血管的异常形成。
抗血管生成疗法已成为治疗儿童髓母细胞瘤的一种潜在策略。血管新生是肿瘤进展的标志之一。血管生成是一个动态过程，新生血管通常受到刺激因子和抑制因子的调节。然而，在肿瘤的病理状态下，这种“血管生成平衡”可能会失衡；血管生成诱导因子的失调或过度产生往往会导致异常血管的过度形成。最近的研究发现，内皮细胞产生的内源性血管生成抑制剂可通过正反馈和负反馈调节血管生成，VASH2（Vasohibin-2）就属于这类调节剂。
血管生成抑制因子家族包括血管抑制素1、VASH1（Vasohibin-1）和血管抑制素2（VASH2），其中VASH1是血管生成的负调控因子，抑制血管生成；VASH2作为VASH1的同源物，其作用与VASH1相反，在机体损伤修复过程中促进血管生成。研究人员发现，VASH2通过上皮-间质转化（EMT，指胚胎发育、创伤愈合和纤维化疾病的重要基本机制）过程促进胰腺癌和卵巢癌等实体瘤的进展。基因表达分析表明，VASH2在人类和小鼠胚胎发育过程中在内皮细胞中表达，出生后这些表达消失。VASH2在单核细胞中表达，单核细胞浸润发生在新生血管萌发的前端，并促进血管生成。有研究表明，VASH2在胃癌、肝癌、卵巢浆液性恶性肿瘤等实体瘤细胞中异常表达，VASH2在癌细胞的发生过程中发挥着重要作用。
众所周知儿童髓母细胞瘤是一种胚胎来源性肿瘤，髓母细胞瘤起源于胚胎时期的干细胞，这些干细胞会分化成神经细胞和支持细胞。然而，在某些情况下，这些细胞的正常分化过程被干扰，导致它们异常增殖并形成肿瘤。而VASH2基因与胚胎之间同样存在一定的关系。VASH2是一种由人类基因VASH2编码的蛋白质。它在胚胎发育和血管生成过程中发挥重要作用。研究表明，VASH2蛋白在胚胎发育的早期阶段起着关键的调控作用。它参与胚胎的血管形成和血管系统的发育。具体而言，VASH2蛋白在血管内皮细胞中表达，并参与调控血管新生和血管密度。它通过抑制血管内皮生长因子（例如VEGF）的作用，调节血管生成的过程。
此外，VASH2蛋白在胚胎发育过程中还与神经系统的发展有关。研究发现，在胚胎的神经生长锥体和神经元迁移过程中，VASH2蛋白的表达起着重要的调控作用。它可以影响神经元的生长和分化，并参与神经系统的形成和连接。在其他实体瘤的研究中显示，VASH2在肿瘤进展过程中会在一定程度上促进肿瘤的生长，但由于肿瘤进展是一个复杂的过程，VASH2其促进作用值得我们去深入研究，基于以上研究背景我们选择了VASH2与髓母细胞瘤作为研究对象。
1、材料和方法
2、结果
讨论
儿童髓母细胞瘤具有侵袭性强、易复发、预后差等特点。即使手术切除后，放化疗也可能引起认知功能受损等一系列并发症，严重影响患儿的远期预后，给患儿家庭和社会带来沉重负担。随着科学技术的进步，肿瘤精准化、个体化治疗的理念被提出，在儿童神经肿瘤学中探索高效、安全的诊断和治疗靶点开发显得尤为重要。人类进入分子时代以来，深度测序技术在肿瘤研究中的应用使研究者对肿瘤有了更清晰的认识，更多的肿瘤分子亚型概念被提出，为精准治疗提供了理论支持。2021年WHO将儿童髓母细胞瘤重新定义为4个亚型：WNT、SHH-TP53野生型、SHH-TP53突变型和非WNT/SHH型，将之前的第3组和第4组类型并入非WNT/SHH型。据报道，SHH型髓母细胞瘤在所有类型的髓母细胞瘤患者中发病率最高，约占1/3，且易发生早期转移。SHH型髓母细胞瘤往往伴有SHH信号通路的异常激活，研究表明，该通路的异常激活往往会影响小脑的正常发育。在其他实体瘤中，SHH通路的异常激活会导致肿瘤发生，如皮肤基底癌和消化道肿瘤。此外，该通路下游蛋白（如Smo、Gli1、Gli2等）的异常表达与SHH型髓母细胞瘤的发生有重要关系。SHH型髓母细胞瘤患儿的预后因人而异，SHH-TP53突变的患者预后最差，而SHH-TP53野生型患者预后相对较好。因此，对SHH髓母细胞瘤患者实施个体化精准治疗，探索新的诊治靶点具有重要意义。据早前报道，SHH型髓母细胞瘤的治疗主要针对SHH相关信号通路蛋白的抑制剂展开，在以往的临床试验中取得了满意的疗效。在本研究中，SHH型儿童病例同样占比最高。目前，国内外尚无关于VASH2在中枢神经系统肿瘤，尤其是儿童髓母细胞瘤中的作用和机制的报道，因此，研究VASH2与SHH型髓母细胞瘤发病机制的相关性，对提高SHH型髓母细胞瘤患儿的预后具有重要意义。
本研究通过免疫组化方法检测了VASH2在儿童髓母细胞瘤组织中的表达水平，发现VASH2的阳性表达率与髓母细胞瘤的分子分型密切相关。随后，我们在SHH髓母细胞瘤细胞系DAOY中进行了VASH2调控模型实验，并对GEO数据库中获取的两个髓母细胞瘤数据集GSE30074和GSE202043（髓母细胞瘤样本）及其相应的临床信息。进行Kaplan-Meier分析，以K-M曲线呈现数据。与此同时，还专门针对VASH2基因进行了全面的GO富集分析，揭示了其错综复杂的分子谱系的基本生物学通路。最后利用STRING数据库得到VASH2的PPI互作网络，对VASH2相关基因进行了富集分析。对数据集中的研究结果部分支持了我们的研究结论，同时也提示我们未来更全面的揭示VASH2在儿童髓母细胞瘤中的具体作用机制，不仅需要我们增加样本量，同时还需从体内、体外、不同分子分型的髓母细胞瘤中开展研究。
本次研究初步阐明了VASH2在SHH髓母细胞瘤细胞系DAOY中的生物学功能，并对其相关信号通路进行了初步探索，为探索儿童髓母细胞瘤新的诊断和治疗靶点提供理论依据。在最近的一项研究报告中，研究人员发现VASH2在胃癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌等一些实体瘤中表达水平异常升高，并在细胞旁分泌情况下促进肿瘤血管生成，与肿瘤预后密切相关。有研究表明，敲降VASH2能显著增加肿瘤细胞对紫杉醇PTX的化疗敏感性。VASH2通过激活SHH通路增加了胰腺肿瘤中ZEB1/2的表达，既促进了EMT过程，又增加了胰腺肿瘤对吉西他滨的化疗耐药性。另一项关于肝脏肿瘤的研究也得出了同样的结论。此外，在一项关于非小细胞肺癌的研究中，研究人员发现VASH2通过AKT信号通路促进肿瘤细胞增殖和对阿霉素的耐药性。正如早期研究所示，微管作为真核细胞骨架的重要组成部分，参与了多种细胞功能。VASH2具有非典型的酪氨酸催化结构，可影响细胞中微管蛋白的翻译后修饰，并参与酪氨酸循环和降解。然而，酪氨酸循环失调与疾病和癌症密切相关。2021年《自然》杂志报道的一项研究结果表明，微管亲和调节激酶4（MARK4）通过促进微管相关蛋白4（MAP4）的磷酸化，从而促进血管舒张素2（VASH2）进入微管进行α-微管蛋白去酪氨酸化，从而调节心肌细胞的收缩能力。相反，抑制微管脱乙酰化可改善衰竭心肌细胞的收缩力，从而表明VASH2也与心衰的发病机制密切相关。
在本研究中，我们利用免疫组化技术探索了VASH2的高表达水平与髓母细胞瘤的病理特征（如SHH亚型）之间的潜在相关性，同时发现在WNT型髓母细胞瘤患儿中，VASH2的表达水平最低，提示VASH2可能是预测髓母细胞瘤分子亚型的潜在诊断靶点。此外，细胞周期包括间期和分裂期（M期），分裂期由三个阶段组成：DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）和DNA合成后期（G2期）。在G1期，细胞合成RNA和蛋白质，而在S期，细胞主要进行DNA合成。在本研究中，我们发现调控VASH2在SHH髓母细胞瘤细胞系DAOY中的过表达会增加Daoy细胞周期中的S期，而敲降VASH2会缩短Daoy细胞周期中的S期。VASH2可影响Daoy细胞周期中的DNA合成。
细胞凋亡是由基因控制的细胞程序性死亡过程，是细胞内环境平衡下的一个活跃过程。细胞凋亡在生物体的许多生物发育过程中都扮演着重要角色，如体内新旧细胞的更替、生物胚胎发育、疾病和肿瘤进展等。在大多数肿瘤中，肿瘤细胞的无限增殖与细胞凋亡密不可分。本研究结果显示，VASH2在髓母细胞Daoy中过表达会导致髓母细胞中Bcl2（B细胞淋巴瘤/白血病-2基因）的表达水平显著升高，而敲降VASH2则会显著抑制SHH髓母细胞瘤细胞系DAOY中Bcl2的表达。同时，调控VASH2后髓母细胞Daoy中Caspase3的变化趋势与Bcl2的变化趋势一致。Bcl2基因是一种原癌基因，具有抑制细胞凋亡的作用，早期研究表明，Bcl2是SHH信号通路的下游靶基因，而SHH髓母细胞瘤细胞系DAOY中的SHH信号通路又来源于SHH型髓母细胞瘤。Bcl2在细胞中的过表达可保护细胞免受Fas配体诱导的细胞死亡。基础研究结果表明，Bcl2可增强大多数肿瘤细胞对DNA损伤的抵抗力，从而提高对化疗药物的耐受性，但Bcl2并不能促进DNA的自我修复。p53也是一种癌基因，半数以上的恶性肿瘤都会发生该基因的突变，也是DNA损伤的分子指标，研究表明Bcl2可抑制p53介导的细胞凋亡。一项研究结果表明，VASH2可通过下调p53抑制肝脏肿瘤细胞的凋亡，而早前的研究结果表明，p53基因在SHH髓母细胞瘤细胞系DAOY中高表达，因此提示VASH2也可通过p53基因介导SHH髓母细胞瘤细胞系DAOY中的凋亡。Caspase3是细胞凋亡过程中的重要执行者。一项研究表明，过表达VASH2会导致细胞内Caspase3的丰度升高。这一发现也与我们本次研究的结果一致。以上研究结果表明，VASH2可以调控SHH髓母细胞瘤细胞系DAOY中的凋亡能力，VASH2可能是髓母细胞瘤生物学过程中的一个重要调控因子。
恶性髓母细胞瘤最重要的生物学特征之一是具有侵袭性生长。髓母细胞瘤细胞往往在早期侵入周围正常脑组织，很难与正常脑组织有明显的界限区分。本研究首次发现，VASH2在儿童髓母细胞瘤中的异常表达与髓母细胞瘤的分子亚型密切相关，VASH2主要通过TGF-β信号通路调控髓母细胞瘤的侵袭、迁移、细胞周期和凋亡。这提示它参与了儿童髓母细胞瘤的进展，并在髓母细胞瘤的发生和发展过程中发挥着重要作用，可作为髓母细胞瘤诊断和治疗的靶点。
局限性
本研究存在一些局限性。由于丢失病例较多，本研究最终纳入的样本量为47例，探讨VASH2与髓母细胞瘤的预后关系仍需今后在大样本队列中进行研究。此外，目前髓母细胞瘤分子分型的金标准主要依靠DNA甲基化检测，但该方法价格昂贵，且对肿瘤组织的保存和运输有特殊要求，因此本研究采用了性价比较高的免疫组化方法对髓母细胞瘤进行分子分型，我们的实验主要利用SHH髓母细胞瘤细胞系DAOY进行研究，这种细胞系是目前国际上研究髓母细胞瘤中基因功能的常用模型，被广泛用于许多髓母细胞瘤相关研究中。此外，我们使用了多种实验方法以确保研究结果的可靠性和重复性，尽管我们最初意识到单一细胞系的使用可能限制了我们研究的深度和广度，但在未来的研究中，我们将尝试使用其他髓母细胞系进行同步验证，并将在动物层面进行实验研究，以进一步加强我们的研究结果。
结论
我们首次发现VASH2的阳性表达率与SHH型儿童髓母细胞瘤密切相关，VASH2通过影响TGF-β通路的下游指标参与SHH髓母细胞瘤细胞系DAOY的侵袭、迁移、细胞周期和凋亡能力。VASH2有望成为SHH型儿童髓母细胞瘤的诊断和治疗靶点。
第一作者简介
刘文 硕士研究生
新疆医科大学第一附属医院神经外科中心
主要研究方向为神经肿瘤临床与基础研究
参与国家自然科学基金地区项目1项，参与上海合作组织科技伙伴计划和国际科技合作计划项目1项，主持自治区研究生创新项目1项
发表SCI 2篇，中文核心期刊2篇
通讯作者简介
汪永新 教授
新疆医科大学第一附属医院神经外科中心
博士，主任医师，教授，博士生导师
新疆医科大学第一附属医院神经外科中心主任；兼任国家卫生健康委能力建设和继续教育神经外科学专家委员会委员、中华医学会数字医学分会委员、中国医师协会神经外科医师分会委员、中国医师协会胶质瘤委员会小儿肿瘤专委会委员、中国医药教育协会神经肿瘤专委会副主任委员、新疆医学会神经外科专业委员会副主任委员、新疆神经外科质量控制中心主任委员、新疆抗癌协会神经肿瘤专业委员会主任委员等
长期从事脑肿瘤、脑创伤及小儿神经外科疾病的临床诊治、教学及科研工作
荣获2021年度人民好医生（神经肿瘤）特别贡献奖，近年来先后获得省级科技进步二等奖及三等奖5项；主持及参与3项国自然项目、自然基金重点项目，10余项省级科研项目；以第一作者及通讯作者发表SCI及中华系列等核心期刊论文60余篇；出版著作8部；参加国家级诊疗指南及专家共识编撰工作12项
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