【中国声音】脑深部刺激改善帕金森病中枢神经系统炎症：证据和展望

第一作者：常磊，董文文

通讯作者：章文斌

其他作者：罗备，邱畅，卢越，林兴建

作者单位：南京医科大学附属脑科医院

REF: Chang L, Dong WW, Luo B, et al. Deep brain stimulation improves central nervous system inflammation in Parkinson's disease: Evidence and perspectives [published online ahead of print, 2023 Mar 21]. CNS Neurosci Ther. 2023;10.1111/cns.14167. doi:10.1111/cns.14167

PMID: 36942520

关键词：帕金森病，脑深部刺激，正受激活调节正常T细胞表达和分泌因子，肿瘤坏死因子α，炎症，免疫紊乱

背　景

在帕金森病中，炎症可能导致多巴胺能神经元的退化。之前的研究表明，炎症介质主要促成了这种现象。另一方面，脑深部刺激等侵入性神经调控方法对PD具有更好的治疗效果。其中一个可能性是DBS通过影响炎症来改善PD。因此，我们进一步探索了炎症介质和DBS在PD发病中的作用机制。

方　法

我们使用Luminex分析方法测量了109名术前进行DBS的PD患者、49名术后进行DBS的PD患者以及113名年龄和性别匹配的对照组中的两个炎症标志物，即RANTES和TNF-α的血清水平。随后，对不同组别的血浆蛋白数据进行了统计分析。

结　果

在这三个组别之间，RANTES（p<0.001）和TNF-α（p=0.005）的水平差异显著。在术前PD患者中观察到RANTES水平与Hoehn-Yahr（H-Y）分级之间的强烈且显著的相关性（rs=0.567，p<0.001）。在匹配的患者中观察到RANTES水平与统一帕金森病评定量表Ⅲ（UPDRS III）评分之间的显著相关性（rs1=0.644，p=0.033和rs2=0.620，p=0.042）。TNF-α水平则没有观察到相关性。

结　论

这项研究的结果表明，PD患者存在持续的炎症特征，可能是通过激活单核细胞、巨噬细胞和T淋巴细胞并将它们招募到中枢神经系统（CNS）中实现的。DBS显示出对PD具有显著的治疗效果，可能是通过改善中枢神经系统的炎症环境实现的。

引言

帕金森病是一种常见的神经退行性疾病，发生在中老年人，由于黑质致密部（SNpc）多巴胺能神经元的死亡引起，导致多巴胺缺乏和多巴胺与乙酰胆碱神经递质水平失衡。这些变化导致震颤、肌张力增高、运动缓慢、姿势不稳和步态困难等运动症状。目前，PD的具体发病机制尚不清楚。一个假设是PD患者基底神经节多巴胺能神经元的自噬导致线粒体和溶酶体的功能结构紊乱，而其他人认为PD患者之间的神经元信号传递的蛋白质也存在异常。因此，神经炎症和免疫紊乱理论最近成为PD研究的热门话题。

中枢神经系统（CNS）中的神经炎症以小胶质细胞和星形胶质细胞的激活为特征，它们产生各种炎性因子和趋化因子，破坏血脑屏障（BBB）并促进多巴胺能神经元的退化。T细胞的独立或联合作用也参与了这个过程。因此，诸如RANTES和TNF-α等促炎因子可能是解锁PD发病机制的关键。RANTES是一种C-C β趋化因子，对T淋巴细胞和单核细胞具有强烈趋化活性。趋化因子在人体炎症免疫过程中由激活的巨噬细胞和小胶质细胞释放，炎症细胞分泌RANTES等炎性因子来招募额外的炎症细胞参与炎症反应。TNF-α对多巴胺能神经元具有潜在的细胞毒性作用，它是一种重要的免疫信号分子。它主要由星形胶质细胞和小胶质细胞在CNS中产生，可以诱导神经毒性物质的释放和炎性因子的合成，其持续释放会加重对多巴胺能神经元的损伤。

多项研究报道了炎症与帕金森病之间的联系。在PD患者的尸检研究中，发现脑组织和脑脊液中的促炎细胞因子和趋化因子，尤其是RANTES和TNF-α的表达上调。Tang等人的研究表明，炎症介质可能反映了系统性炎症在PD神经退行性过程中的作用。PD患者的血清RANTES水平高于对照组，并且RANTES水平与患者的H-Y分级和病程持续时间呈强相关。以往的研究报道了PD患者血清TNF-α水平显著高于对照组，但与疾病严重程度等因素之间没有显著相关性。

直到最近，帕金森病主要通过药物进行治疗。然而，随着技术的进步和治疗理念的改变，新的治疗方法如手术和康复治疗等出现了。与核团毁损手术相比，DBS具有高效、微创、可逆和可调节的优点。虽然DBS可以控制PD患者的运动症状，但由于大脑区域环境的复杂性，其完整的作用机制仍不清楚。

当前的研究旨在检查PD患者和对照组中血浆RANTES和TNF-α水平的变化。研究目标是验证和探索DBS对血浆生物标志物的影响，并研究DBS疗效是否与神经炎症反应和免疫失衡有关。

材料和方法

病人和对照组

在这项回顾性研究中，我们招募了2017年10月至2019年10月期间在南京医科大学附属脑科医院接受治疗的158名帕金森病（PD）患者。所有患者根据运动障碍学会PD临床诊断标准由两名神经内科医生诊断为PD，并满足以下标准：（i）在任何血清学检查或临床检查中无活动性感染或全身性炎症的证据；（ii）在招募前3个月内没有使用类固醇、非类固醇或抗炎药物；（iii）没有认知功能障碍，如痴呆、谵妄和包括焦虑和抑郁障碍在内的精神障碍的证据；（iv）愿意并能够参与长期随访。根据干预的不同，PD患者被分为术前组（n=109）和术后组（n=49）。对照组（n=113）从南京医科大学附属脑科医院体检中心招募。对照组中的所有人都是健康的，没有神经退行性疾病的症状。该研究已获得南京医科大学附属脑科医院伦理委员会的批准，所有参与者在入组前提供了书面知情同意。

靶点，DBS参数和左旋多巴等效剂量

所有的DBS手术均由神经外科医生以统一流程的方式进行。目标和路径规划由同一名手术工程师进行，并由外科医生确认。在所有患者中，双侧STN被选为手术植入目标。术前颅脑3.0T MRI和带框头颅CT数据被导入Surgiplan软件以制定手术计划。以前联合和后联合的中点为原点建立笛卡尔坐标系。STN目标位于原点旁边的11-12毫米处，向后3毫米，向下4毫米。手术过程中，使用Omega电生理仪器（Alpha Omega Engineering有限公司，Nazareth Illit，ISR）和记录电极监测STN核的单细胞放电以确定电极植入的深度；记录电极最终被移除以植入DBS电极（电极型号L301，北京品尔方医疗器械有限公司，中国北京）。术前颅脑MRI和术后头颅CT数据融合确认了电极放置位置的准确定位。为避免微毁损效应，患者在手术后两周开始启动装置，初始参数如下：电压1.5-2.0V，脉冲宽度60微秒，频率130Hz。由于DBS的个体化特性，参数根据每个患者的情况进行调整。大多数患者术后不改变LED剂量；只有少数患者由于运动障碍需要调整LED剂量。所有的启动参数和附加数据将在补充材料中提供。

样本采集和分析

在静息状态下，于上午8:00至10:00之间采集外周静脉血样本（5mL），在停药（OFF-medication）/开启DBS（ON-DBS）后经过12小时的洗脱期。为避免术后炎症的影响，术后1个月再次采集血样。样本在室温下凝固30分钟后，以3000rpm离心15分钟。然后，收集上清液，转移到1.5mL的冷冻保存管中，并在-80℃保存，直至进一步分析。分析使用来自Millipore Corporation的Luminex试剂盒（美国马萨诸塞州）。按照制造商的说明进行试验，以确定40种蛋白质的血浆水平。适当稀释的血浆样品与抗体偶联微球孵育，然后与生物素化检测抗体孵育，然后加入链亲和素-植红蛋白。捕获的微球复合物使用FLEXMAP 3D系统（Luminex Corporation，美国德克萨斯州）进行测量，仪器设置如下：每个微球事件数为40，样本大小为50μL，鉴别门限为8000-15000。收集原始数据（平均荧光强度），然后进一步处理以计算蛋白质浓度。

数据预处理

在进行统计分析之前，对每项检测进行了质量检查（QC）。使用xPONENT 5.1（Luminex Corporation，TX，USA）测量中位荧光强度（MFI），并导出到Milliplex Analyst 5.1（VigeneTech Corporation，MA，USA），使用五参数逻辑拟合估计蛋白质的浓度。简而言之，所有通过基于四个标准（标准曲线线性度、测定内变异系数、参考样品测定间变异系数和数据缺失百分比）的质量控制检查的分析物都进行了进一步分析。然后，我们用热图法（软件包pheatmap 1.0.12版，图1）对40种血浆蛋白的含量对数进行了差异分析。RANTES和TNF-α水平显示出上调。火山图显示了对数倍变化和-log10 p值之间的关系（软件包ggplot2版本3.3.6，图2，表1）。使用1.50的阈值倍数变化对不同表达的血浆蛋白进行筛选。观察到类似的结果。在讨论中解释了结果中的任何不一致之处。

统计分析

分别用Shapiro-Wilk检验和Levene检验来确认所有变量的正态性和方差的同质性的假设。由于偏离正态分布或方差的异质性，使用非参数检验（Mann-Whitney检验，Kruskal-Wallis检验）来比较组间RANTES和TNF-α水平。除非另有规定，当数据符合正态性时，使用t检验。Spearman相关系数用于评估所有数据之间的关系。单向方差分析（ANOVA）和卡方检验也在适当时候使用。在正态分布下，数据以平均值±标准差（SD）表示，在偏态分布下，以中位数（四分位数范围，IQR）表示。结果在P<0.05时被认为具有统计学意义。统计分析使用SPSS 26（IBM，Chicago，IL，USA）和R软件（4.2.0版）进行。

结果

表2总结了参与者的临床和人口学特征。各组之间在性别、年龄或H-Y期方面没有明显差异，但在病程时间方面有明显差异（P=0.005）。与对照组相比，PD组的RANTES和TNF-α水平有明显差异（分别为P<0.001和P=0.005）。比较显示，术前和术后组与对照组之间的RANTES和TNF-α水平明显增加（*p<0.001，△p<0.001，✦p=0.005，▲p=0.002，图3，图4）。由于其他组没有变化，所以只分析了手术前组的H-Y分期和炎症标志物水平之间的关系。在手术前组，血清RANTES水平与H-Y分期相关，显示出强烈的正线性关系（n=113，rs=0.567，p<0.001，图5）；然而，TNF-α水平与H-Y分期不相关。为了进一步探讨相互作用，我们检查了另外11名患者的术前和术后血样（表3）。与术后组相比，术前组的UPDRS Ⅲ评分、RANTES和TNF-α水平明显较高（P=0.001，P=0.033，P=0.027）。正如预期的那样，两组的RANTES水平和UPDRS Ⅲ评分之间有很强的明显相关性（n=11，rs1=0.644，p=0.033；rs2=0.620，p=0.042，图6）。TNF-α和RANTES水平也显示出相关性，虽然没有统计学意义，但表明有一致的炎症反应（n=11，rs1=0.545，p=0.083和rs2=0.636，p=0.035）。

讨论

DBS可以有效地改善运动波动症状、运动障碍，延缓疾病的进展，但并不能体现完全治愈。因此，PD的治疗理念是尽早诊断和治疗，延缓疾病的进展。由于PD早期诊断的挑战，研究人员试图寻找具有诊断意义的生物标志物。在本研究中，我们发现PD患者的血浆生物标志物RANTES和TNF-α具有潜在的研究价值，因此值得进一步调查。虽然筛查结果并不显著，但这可能是由于样本量较小或患者中可能存在一些疾病的隐性进展。我们的研究结果还表明，从DBS治疗的角度来看，血浆生物标志物与手术疗效之间存在着相关性。在未来的研究中，我们计划对上述生物标志物进行研究，探讨PD发病机制是否与免疫炎症反应有关。我们还将探讨血浆生物标志物与手术疗效之间的相关性，从而为进一步研究DBS的治疗机制提供临床依据。

RANTES也被称为CCL5，参与了人类的炎症免疫过程。当炎症细胞分泌RANTES时，它们往往在炎症反应中招募更多的T细胞。一些研究表明，在神经退行性疾病中，全身性炎症和神经元损伤之间存在相互作用。例如，在PD和阿尔茨海默病（AD）中，最初的疾病发病可能是中枢神经系统内非免疫介导的损伤。Dutta等人使用PD小鼠模型，证明RANTES诱导的Th17细胞侵入黑质，加剧了DAergic细胞的损失。在本研究中，我们发现PD患者的血浆RANTES水平高于健康人。这一发现与以前的报告一致，并支持我们的观点，即炎症状态在PD的发展中起作用。然而，关于血浆RANTES水平与疾病严重程度之间的相关性的研究结果并不一致。我们的研究结果与Tang等人的研究结果一致，因为我们在11名配对患者中发现血浆RANTES水平与PD严重程度（基于H-Y分期和UPDRS Ⅲ评分）之间存在正相关关系。这可能是由于PD患者血液中RANTES的产生增加。Reale等报道，PD患者外周血单核细胞培养上清液中的RANTES含量比健康对照组高1.7倍，进一步支持这一理论。有趣的是，手术干预后，PD患者的血浆RANTES水平较手术前有所下降，且手术后患者与健康对照组无明显差异，提示丘脑底核脑深部刺激（STN-DBS）可改善PD患者的血浆RANTES水平。在涉及更精细的患者细分的进一步分析中，我们发现PD患者的RANTES含量，H-Y 2.5期和3期患者手术前后的RANTES含量没有统计学意义，但可能有意义。之所以没有达到统计学意义，可能是因为样本量有些小。

TNF-α是一种重要的炎症因子，在中枢神经系统炎症期间由异常激活的胶质细胞产生。由TNF-α介导的神经炎症事件导致DA能神经元进行性变性，这在PD发病机制中起着重要作用。以前的研究表明，PD患者的脑组织和脑脊液中TNF-α的浓度明显高于对照组，表明PD患者的黑质纹状体区域可能发生免疫反应，至少与神经元变性有部分关系。类似的结果在动物实验中也有报道。例如，用1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶/丙炔（MPTPp）长期治疗小鼠，导致CD11激活后甘露糖受体C型1（MRC1）和转化生长因子-β（TGF-β）表达下调、以及TNF-α和白细胞介素-1β（IL-1β）表达的上调，表明免疫反应的发展导致多巴胺能神经元的死亡。相反，TNF-α受体基因的敲除对PD小鼠有保护作用。在本研究中，我们发现PD患者和健康受试者之间的TNF-α水平有明显差异，而且这种差异在手术后患者和健康受试者之间消失了。此外，我们观察到TNF-α和RANTES水平之间的相关性，表明这两种血浆蛋白在PD中具有协同作用。TNF-α可能诱导细胞因子的表达，如CXCL6。然而，到目前为止，还没有研究涉及到趋化因子和PD之间的相关性。在我们的研究中，TNF-α水平与疾病严重程度之间缺乏关联。我们不能排除机会或个体差异的影响。增加样本量或测量TNF-α的清除率可能有助于解释这一意外结果。

通过首次比较PD患者手术前后血浆RANTES和TNF-α水平的变化，本研究表明，DBS可能通过改善全身免疫炎症反应来推迟PD的进展。在对左旋多巴的研究中，左旋多巴或多巴胺激动剂似乎可以防止免疫紊乱的发生，因为与受试者或接受治疗的PD患者相比，未接受治疗者的血清RANTES水平明显较高。我们推测DBS可能有类似的作用，如通过改善PD患者的全身免疫炎症反应来减少体内的炎症因子，从而减轻对神经元的进一步损害。然而，对细胞和分子机制的进一步研究是必要的。虽然对其他相关的促炎症因子进行了比较，但这里没有介绍结果。例如，对于IL-6和CRP等蛋白质，实验结果显示干预前后没有明显差异。然而，在之前的一些研究中，研究人员报告了这些蛋白质的差异。值得注意的是，显示在PD中增加的IL-6和CRP浓度也存在于正常的生理学中，并在老年大脑中增加。有证据表明，在衰老的大脑中存在慢性神经炎症，其特点是免疫反应性升高和细胞因子的低规模持续产生。我们认为，必须考虑这种伴随性的影响。在随后的研究中，我们将重点探索这种相互关系。

限制性

该研究有几个局限性。由于本研究是一项回顾性研究，且手术方法和程序经过了优化，无法增加更多的样本来支持实验结果。由于研究设计不完善，导致匹配的患者数量较少，进一步的研究应包括更多的匹配患者。最后，与神经系统相关的炎症蛋白的发现需要进一步的实验支持。因此，在未来的研究中应进行系统的评估。

结论

这项研究显示，PD患者和匹配的对照组之间的血清RANTES和TNF-α水平存在明显差异。我们的研究结果表明，PD患者存在持续的系统性炎症状况，RANTES和TNF-α水平是PD的潜在血浆生物标志物。此外，RANTES和TNF-α水平的升高与PD的严重程度有关，在配对比较中，RANTES水平与UPDRS评分相关。这些结果支持DBS对PD的有效性，并表明其作用机制可能涉及改变系统性炎症反应。不幸的是，我们无法进一步探索细胞-分子机制。在未来的研究中应阐明PD患者血浆炎症因子的来源，并进一步研究DBS的机制，以促进延迟甚至治愈PD。

通讯作者简介

章文斌主任医师

南京医科大学附属脑科医院功能神经外科

教授，主任医师，博士生导师

主要从事帕金森等运动障碍疾病的外科治疗，近年主持国家重点研发计划子课题及省级重点研发项目等课题5项，发表学术论文50余篇，建立华东地区最早的远程程控中心

《临床神经外科杂志》副主编、编辑部主任

中国医师协会神经调控专业委员会委员

中国医师协会神经外科分会神经电生理监测专业委员会委员

世界华人医师协会、世界华人神经外科协会功能神经外科专业委员会常委

中国神经调控联盟常务理事

湖南省癫痫与帕金森专病联盟特聘专家

国家神经外科手术机器人应用示范项目专家指导委员会委员，作为专家组成员参与制定多个神经调控专家共识

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