苏州大学附属第一医院神经外科陈罡教授等的研究明确了雌激素与SHH信号通路之间的相关性，并阐明雌激素对aSAH后血脑屏障功能的保护作用。结果发表在2022年12月的《Stroke & Vascular Neurology》在线。
——摘自文章章节
【Ref: Zhang J, et al. Stroke Vasc Neurol. 2022 Dec 16;svn-2022-001907. doi: 10.1136/svn-2022-001907. [Epub ahead of print]】
既往研究表明，性别差异与动脉瘤性蛛网膜下腔出血（aSAH）发病率和临床预后相关。血脑屏障（BBB）破坏、血管痉挛、神经元坏死和凋亡是aSAH后脑损伤的主要病理生理过程。雌激素可通过下调TNF-α和iNOS表达减少aSAH后脑血管痉挛的发生和神经元凋亡。在肾上腺皮质细胞和胃癌细胞中，雌激素通过与其受体结合上调SHH通路。而SHH通路在维持血脑屏障完整性中起关键作用。雌激素是否可以通过SHH通路改善aSAH后血脑屏障损伤尚不清楚。苏州大学附属第一医院神经外科陈罡教授等的研究明确了雌激素与SHH信号通路之间的相关性，并阐明雌激素对aSAH后血脑屏障功能的保护作用。结果发表在2022年12月的《Stroke & Vascular Neurology》在线。
研究者收集20例aSAH患者脑脊液标本，将样品离心20分钟后，取上清液进行酶联免疫吸附试验（ELISA）。作者以基因型和基因表达量数据库（GTEx）中的数据为基础，通过GEPIA计算雌激素受体基因（ESR1、ESR2）的表达、SHH信号通路与紧密连接蛋白（TJs）之间的Pearson相关系数，并使用Python绘制热图。研究者制作aSAH大鼠模型。在实验1中，将aSAH大鼠模型随机分为正常组、溶媒对照组和雌激素组，每组6只大鼠。在雌激素干预3天后收集脑组织进行免疫荧光检测。在实验2中，将aSAH大鼠随机分为7组，包括1个假手术组和6个aSAH组，每组6只大鼠；收集aSAH后6小时、12小时、24小时、48小时、72小时和168小时的脑组织进行蛋白印迹检测。在实验3中，将aSAH大鼠分为假手术组、aSAH组、aSAH+溶媒对照组、aSAH+雌激素组（33μg/kg）、aSAH+雌激素+氟维司群（2mg/kg）组、aSAH+雌激素+环巴胺（1mg/kg）组；每组6只大鼠，在给药后3天采集脑组织进行免疫荧光和蛋白印迹检测。将人脑微血管内皮细胞（hBMVEC）置于无酚红的DMEM培养基中，并加入10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素，以避免酚红的拟雌激素作用。干预组分别给予氧合血红蛋白（20μM）、氧合血红蛋白+人重组SHH（0.1μg/mL）、氧合血红蛋白+HrSHH+环巴胺（10μM）处理24h，并与对照组一起采集组织标本。
脑脊液标本的雌激素浓度与SHH相关性分析显示，雌激素含量与SHH呈中度正相关（R=0.6，p＜0.05）。作者利用GTEx数据库中的数据分析，雌激素受体、SHH信号通路和TJs的转录表达之间的关系；结果表明雌激素受体中，各基因表达与SHH信号通路均呈正相关（R＞0.2，p＜0.05），ESR2基因表达与SHH不相关，但p值＜0.05。进一步分析显示，雌激素受体与SHH基因、SHH信号通路基因、TJs基因之间均呈正相关（R＞0.2，p＜0.05）。
作者使用GFAP作为星形胶质细胞的标记，NeuN作为神经元的标记，经免疫荧光检测发现，SHH在两种细胞中均有表达。经雌激素处理3天后，颞基底皮质脑组织中SHH表达增加。在使用Isolectin B4作为内皮细胞标志物时，发现SHH在内皮细胞中不表达。细胞计数分析发现，雌激素干预没有改变GFAP+星形胶质细胞和NeuN+神经元的数量，SHH表达的细胞比例未明显改变。对颞基底皮质脑组织的SHH进行半定量分析，经雌激素干预3天后，SHH显著增加。结果表明雌激素显著增加神经元和星形胶质细胞对SHH的合成。
在颞叶基底皮质脑组织中，western blotting检测SHH蛋白表达结果，与假手术组相比，SHH在3d时明显降低，7d时略有恢复。作者通过在aSAH前后分别对大鼠进行3天的雌激素干预，并采用western blotting确定SHH信号通路中蛋白表达的改变；结果显示，与假手术组相比，aSAH后72 h时SHH信号通路中SHH、PTCH1、SMO和GLI1的表达明显降低，但经雌激素干预6天后可见降低的蛋白恢复。与单独给药组相比，同时给予雌激素和其受体抑制剂氟维司坦组未观察到逆转。综上所述，aSAH后星形胶质细胞数量增加，但神经元数量没有增加。aSAH后，SHH在星形胶质细胞和神经元中的表达均减少，部分星形胶质细胞中未检测到SHH表达，但雌激素可部分逆转SHH表达下降。除此之外，aSAH后内皮细胞中也未见SHH表达。
在TJs蛋白表达检测的体内试验中，与假手术组相比，aSAH后72小时TJs下降。雌激素干预可上调aSAH后TJs的表达。这种干预结果，可被SHH信号通路抑制剂环巴胺逆转。随后，TJs和内皮标志物异凝集素B4的免疫荧光染色证实这种改变。在体外试验中，aSAH组中模拟氧血红蛋白TJs表达比对照组降低。给予HrSHH蛋白干预12小时后，内皮细胞中TJs显著升高。环巴胺可抑制HrSHH蛋白对TJs的上调。
在血脑屏障通透性检测中，aSAH后72小时血脑屏障通透性明显高于假手术组。而雌激素干预组，aSAH后72小时血脑屏障通透性无显著差异，表明雌激素显著逆转aSAH后血脑屏障通透性的改变。在脑水含量测定中，aSAH后72小时脑水含量显著增加，而雌激素则逆转这一趋势。当SHH信号通路被环巴胺阻断时，无法检测到雌激素的逆转变化。
实验性aSAH大鼠经不同干预后的行为测试，发现改良Garcia评分和转棒实验得出的结果相似。aSAH大鼠经雌激素干预后，改良Garcia评分明显高于其它组；转棒实验中停留时间比其它组延长，表明雌激素可改善实验性aSAH大鼠神经功能。同时给予环巴胺组的大鼠中，没有观察到这种变化。此外，在Morris水迷宫实验中，研究者选择逃生潜伏期和车道长度作为评价指标；与其它组相比，雌激素干预组大鼠的潜伏期最短和游动路径长，意味着运动能力更好。以上结果均表明雌激素可通过SHH信号通路减弱神经功能障碍。
该实验结果揭示，雌激素通过上调雌激素受体的SHH信号通路改善血脑屏障稳定性和aSAH后神经功能。但如何特异性刺激大脑中的雌激素受体，减少aSAH引起的脑损伤，以及避免雌激素应用的全身副作用，仍有待于未来的研究。
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