脑胶质瘤是成人最常见的颅内恶性肿瘤，具有高侵袭性和高复发率。药物无法有效通过血脑屏障是导致治疗效果不佳的重要原因之一。课题组前期应用单细胞测序技术对胶质母细胞瘤及其癌旁组织的血管内皮细胞进行单细胞转录组分析，经研究发现：肿瘤血管内皮细胞仍然保持一定程度的血脑屏障特性。大量活性外排转运蛋白和紧密连接分子仍存在于肿瘤内皮细胞中，很可能会影响抗肿瘤药物的有效递送。

在单细胞水平，Wnt信号通路的激活和血脑屏障基因的表达显著相关。因此，本研究的目的是通过在体外血脑屏障模型及体内GBM动物模型，应用Wnt信号阻断剂，探究Wnt信号通路是否可以作为调控血脑屏障，促进胶质母细胞瘤药物的递送靶点，并详细解析Wnt信号通路调控药物递送的分子机制。

本研究应用体外血脑屏障模型（图1A），发现阻断Wnt信号通路可显著增强化疗药物替莫唑胺（TMZ）穿透血脑屏障效率（图1B）。同时，在两种原位胶质母细胞瘤小鼠模型中，使用Wnt信号通路阻断剂LGK974治疗荷瘤小鼠，通过高效液相色谱测定颅内肿瘤中TMZ的含量，发现Wnt信号通路阻断可显著增强TMZ向肿瘤组织递送（图1C-D）。

图1. 阻断Wnt信号通路可显著增强药物递送。

通过对肿瘤血管细胞进行转录组测序分析发现，Wnt信号通路阻断能够降低血脑屏障关键分子Mfsd2a的表达，同时增加血管通透性标记物Plvap和细胞囊泡胞吞转运标记物CAV1的表达（图2）。

图2. Wnt信号通路在肿瘤内皮细胞中调控转胞吞作用相关基因。

应用Mfsd2a敲除（Mfsd2a-ko）小鼠和可持续表达Mfsd2a的Mfsd2a-GOF（Cdh5-CreERT2; ROSA26STOPfloxMfsd2a/TdTomato）小鼠，发现Wnt信号通路调控化疗药物递送依赖Mfsd2a的表达。图3A可见在Mfsd2a-GOF小鼠中未观察到Wnt信号通路抑制所导致的TMZ递送增强。在Mfsd2a-GOF小鼠中，LGK974和TMZ治疗联合治疗的生存获益被逆转（图3B）。以上结果表明，Wnt介导的TMZ递送调节依赖于Mfsd2a的表达。

图3. Wnt信号通路调控化疗药物递送依赖Mfsd2a的表达。

此外，应用体外血脑屏障模型、CAV1敲除（CAV1-ko）小鼠、Cav1/Mfsd2a双敲小鼠，发现降低caveolae介导的细胞胞吞转运后可影响Mfsd2a敲除对化疗药物递送的调控作用。在Mfsd2a敲除小鼠中TMZ递送显著增强，但在Mfsd2a和Cav1双敲小鼠中，增强的TMZ递送被逆转（图4A）。免疫电镜图提示，LGK974治疗导致肿瘤血管内皮中caveolae介导的细胞胞吞作用显著增加（图4B-C）。进一步研究表明，LGK974治疗导致对照小鼠中的TMZ递送增加，但在Cav1敲除小鼠中则未受影响（图4D）；LGK974治疗导致对照小鼠肿瘤中血管内皮细胞转吞囊泡水平增加，但在Cav1敲除小鼠中则未见其变化（图4E-F）。此外，在Cav1敲除小鼠中，TMZ和LGK974治疗对荷瘤小鼠存活率改善的协同作用也被逆转（图4G）。本研究揭示Wnt/Mfsd2a/caveolae-mediated transcytosis轴是提高化疗药物递送的重要靶点（图4H），为胶质瘤的治疗方案设计提供重要依据。

图4. Wnt信号通过在肿瘤血管内皮细胞中增强Mfsd2a介导的胞吞转运作用来增加化疗药物替莫唑胺的递送。