【中国声音】张建民教授团队：LncRNA LINC01018/miR-942-5p/KNG1轴在体外和体内调节胶质瘤的恶性进展

近期，浙江大学医学院附属第二医院神经外科张建民教授团队在神经科学期刊《CNS Neuroscience & Therapeutics》（IF: 7.035/Q1）发表了题为《LncRNA LINC01018/miR-942-5p/KNG1 axis regulates the malignant development of glioma in vitro and in vivo》的研究论文。

本研究基于先前研究证实KNG1对胶质瘤的抑制作用，进一步探讨lncRNA/miRNA轴对KNG1及胶质瘤的调节作用。研究证实：miR-942-5p靶向KNG1，LINC01018吸附miR-942-5p。患者高生存率与miR-942-5p低表达相关。在胶质瘤中，miR-942-5p高表达，KNG1低表达。miR-942-5p与KNG1负相关。沉默LINC01018或KNG1和miR-942-5p模拟物促进胶质瘤细胞的迁移、侵袭和增殖，调控转移和增殖相关基因的表达。LINC01018敲低和miR-942-5p模拟物促进小鼠中的胶质瘤的生长。LINC01018敲低使得miR-942-5p和KNG1的水平降低，miR-942-5p模拟物则抑制LINC01016的表达。miR-942-5p抑制剂、KNG1和LINC01018与MiR-942-5p模拟物的作用相反。得出结论：LINC01018/miR-942-5p/KNG1通路在体外和体内调节胶质瘤细胞的发展。其中LINC01018和KNG1的高表达对胶质瘤有抑制作用，miR-942-5p的高表达对胶质瘤有促进作用。

[REF: Xu J, Wang J, Zhao M, Li C, Hong S, Zhang J. LncRNA LINC01018/miR-942-5p/KNG1 axis regulates the malignant development of glioma in vitro and in vivo[J]. CNS Neurosci Ther, 2023, 29(2): 691-711. doi: 10.1111/cns.14053] PMID: 36550594

胶质瘤是中枢神经系统中最常见的原发恶性肿瘤。胶质瘤尤其是胶质母细胞瘤患者的生存期在过去几十年里仍不理想，没有重大突破性进展。胶质瘤的发生发展等机制研究是促进胶质瘤治疗取得进展的重要理论基础。我们前期的研究已证实KNG1对胶质瘤有抑制作用，本研究进一步探讨lncRNA/miRNA轴对KNG1及胶质瘤的调节作用。

本研究先采用生物信息学分析预测并实验验证靶向KNG1的miRNA和靶向miR-942-5p的lncRNA。分析miR-942-5p与患者生存率的相关性，以及KNG1与miR-942-5p的相关性。转染后通过伤口愈合实验、Transwell实验、菌落形成实验和流式细胞术检测细胞的迁移、侵袭、增殖和细胞周期。建立小鼠皮下异种移植瘤模型。通过RT-qPCR、Western blot和免疫组化检测miR-942-5p、KNG1、LINC01018和相关基因的表达。

图1.提示KNG1在胶质瘤中低表达，与miR-942-5p呈负相关，miR-942-5p在胶质瘤高表达。

（A）通过生物信息学分析（TargetScan、starBase、miRDB和miRWalk）预测可能靶向KNG1的miRNA。

（B、C）通过生物信息学分析预测miR-942-5p和miR-455-5p表达水平与低级别胶质瘤患者生存率的相关性，并采用Kaplan–Meier方法进行分析。

（D、E）miR-942-5p拷贝数、肿瘤组织学分级和初始治疗后肿瘤再次生长之间的相关性。

（F）通过RT-qPCR分析胶质瘤组织中KNG1的表达，以GAPDH作对照。

（G）通过生物信息学分析预测胶质瘤中KNG1的表达。

（H、I）通过RT-qPCR分析胶质瘤组织中miR-492-5p（H）和miR-455-5p（I）的表达，以U6作对照。

（J–M）采用Pearson相关分析法分析胶质瘤患者正常组织和肿瘤标本中KNG1与miR-492-5p（J、K）或miR-455-5p（L、M）的相关性。

（N–P）通过RT-qPCR或Western blot分析正常人星形胶质细胞和人脑胶质瘤细胞系中KNG1（N、O）和miR-492-5p（P）的表达，以GAPDH或U6分别作对照。（*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001 vs. NHA）。

图2.提示siKNG1和KNG1过表达质粒在LN-229和T98G细胞中的转染效率。

（A–H）通过RT-qPCR和Western blot检测转染后LN-229和T98G细胞中KNG1的表达水平。以GAPDH作对照。（***p<0.001 vs. siNC；###p<0.001 vs. NC）。所有实验重复三次。（NC：阴性对照）。

图3.提示沉默KNG1增强LN-229和T98G细胞的迁移和侵袭，而KNG1过表达则相反。

（A–D）愈合试验证实转染siKNG1和KNG1过表达质粒后LN-229和T98G细胞的迁移。

（E–H）transwell试验检测KNG1敲除或过度表达后LN-229和T98G细胞的侵袭（*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001 vs. siNC；##p<0.01，###p<0.001 vs.NC）。（NC：阴性对照）。

图4.提示沉默KNG1通过调节相关基因促进LN-229和T98G细胞的增殖，而KNG1过表达则相反。

（A–H）RT-qPCR或Western blot测定KNG1敲除或过表达后LN-229和T98G细胞中SNAIL1、TWIST1、Vimentin、ZEB1、N-Cadherin和E-Cadherin的表达，以GAPDH作对照。

（I–L）集落形成试验检测KNG1敲除或过度表达后LN-229和T98G细胞的增殖（*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001 vs. siNC；#p<0.05，##p<0.01，###p<0.001 vs. NC）（NC：阴性对照）。

图5.提示MiR-942-5p靶向KNG1并调节KNG1的表达。

（A）TargetScan预测KNG1-3'-UTR含有miR-942-5p的结合位点。

（B、C）荧光素酶报告分析证实miR-942-5p靶向LN-229和T98G细胞中的KNG1（‡‡‡p<0.001 vs. 模拟对照+KNG1-3'-UTR，†††P<0.001 vs. 模拟+KNG1-3'-UTR mut）。

（D、E）RT-qPCR检测转染后LN-229和T98G细胞中miR-942-5p的表达，以U6作对照。

（F–I）Western blot和RT-qPCR检测转染后LN-229和T98G细胞中KNG1的表达，以GAPDH作对照。（***p<0.001 vs. 抑制剂对照；^^^p<0.001 vs. siNC+抑制剂；###p<0.001 vs. 模拟物对照；△△△p<0.001 vs. NC+模拟物）（NC：阴性对照）。

图6.提示KNG1逆转miR-942-5p模拟物对LN-229和T98G细胞迁移、侵袭和增殖的促进作用，siKNG1抵消miR-942-5p抑制剂对两种细胞迁移和侵袭的抑制作用。

（A、B）愈合试验检测转染后LN-229和T98G细胞的迁移。

（C、D）Transwell试验检测转染后LN-229和T98G细胞的侵袭。

（E、F）集落形成试验检测转染后LN-229和T98G细胞的增殖（*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001 vs. 抑制剂对照；^p<0.05，^^p<0.01，^^^p<0.001 vs. siNC+抑制剂；##p<0.01，###p<0.001 vs. 模拟对照；△△p<0.01，△△△p<0.001与NC+模拟物）（NC：阴性对照）。

图7.提示LINC01018在胶质瘤特异性靶向miR-942-5p中低表达。

（A）生物信息学分析预测可能靶向miR-942-5p的lncRNA。

（B–D）生物信息学分析预测胶质瘤中MALAT1（B）、LINC01018（C）和MEG3（D）的表达。

（E、F）RNA pull-down实验检测miR-942-5p是否能与LINC01018和MEG3结合。

（G）starBase预测LINC01018和miR-942-5p之间的推测结合位点。

（H–K）双荧光素酶报告实验（H，I）和RIP实验（J，K）证实LINC01018与LN-229和T98G细胞中的miR-942-5p结合（‡‡‡p<0.001 vs. miR NC+LINC01018，†††p<0.001 vs. miR-942-5p+LINC01018 mut，***p<0.001 vs. Input；###p<0.001 vs. 抗IgG）（NC：阴性对照，RIP：RNA免疫沉淀）。

图8.提示LINC01018过表达和敲低分别逆转miR-942-5p模拟物和抑制剂对LN-229和T98G细胞迁移和侵袭的调节作用。

（A、B）伤口愈合实验检测转染后LN-229和T98G细胞的迁移。

（C、D）Transwell实验检测转染后LN-229和T98G细胞的侵袭（*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001 vs. NC；#p<0.05，##p<0.01，###p<0.001 vs. LINC01018+模拟物；△△p<0.01，△△△p<0.001 vs. shRNA NC；^^p<0.01，^^^p<0.001 vs. shRNA LINC01018+抑制剂）（NC：阴性对照）。

图9.提示LINC01018过表达和敲低分别降低miR-942-5p模拟物和抑制剂对LN-229和T98G细胞中细胞周期分布和相关基因表达的影响。

（A–D）Western blot和RT-qPCR检测转染后LN-229和T98G细胞中SNAIL1、Vimentin、ZO1和E-Cadherin的表达，以GAPDH作对照。

（E、F）流式细胞术检测转染后LN-229和T98G细胞的细胞周期分布（*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001 vs. NC；#p<0.05，##p<0.01，###p<0.001 vs. LINC01018+模拟物；△p<0.05，△△△p<0.001 vs. shRNA NC；^p<0.05，^^p<0.01，^^^p<0.001 vs. shRNA LINC01018+抑制剂）（NC：阴性对照）。

图10.提示LINC01018过表达和敲低分别逆转miR-942-5p模拟物和抑制剂对LN-229和T98G细胞增殖的影响。

（A、B）集落形成实验检测转染后LN-229和T98G细胞的增殖。

（C、D）Western blot检测转染后LN-229和T98G细胞中CDC25A、cycling D1和CDKN2A的表达，以GAPDH作对照（**p<0.01，***p<0.001 vs. NC；#p<0.05，##p<0.01，###p<0.001 vs. LINC01018+模拟物；△p<0.05，△△p<0.01，△△△p<0.001 vs. shRNA NC；^p<0.05，^^p<0.01，^^^p<0.001 vs. shRNA LINC01018+抑制剂）（NC：阴性对照）。

图11.提示LINC01018靶向miR-942-5p调节肿瘤生长。

（A、B）实体肿瘤照片及肿瘤重量。

（C、D）RT-qPCR检测LINC01018在肿瘤组织中的表达，以GAPDH作对照。

（E、F）RT-qPCR检测肿瘤组织中miR-942-5p的表达，以U6作对照（**p<0.01，***p<0.001 vs. NC；###p<0.001 vs. LINC01018+模拟物；△△p<0.01，△△△p<0.001 vs. shRNA NC；^^p<0.01，^^^p<0.001 vs. shRNA LINC01018+抑制剂）（NC：阴性对照）。

图12.提示LINC01018靶向miR-942-5p调节KNG1的表达。

（A、B）Western blot和RT-qPCR检测KNG1在肿瘤组织中的表达，以GAPDH作对照。

（C、D）免疫组化分析确定KNG1在肿瘤组织中的表达。（***p<0.001 vs. NC；###p<0.001 vs. LINC01018+模拟物；△△△p<0.001 vs. shRNA NC；^^^p<0.001 vs. shRNA LINC01018+抑制剂）（NC：阴性对照）。

图13.提示LINC01018靶向miR-942-5p调节微血管密度（MVD）。

（A、B）免疫组化分析LINC01018/miR-942-5p轴对MVD的影响（***p<0.001 vs. NC；#p<0.05，###p<0.001 vs. LINC01018+模拟物；△△△p<0.001 vs. shRNA NC；^^p<0.01，^^^p<0.001 vs. shRNA LINC01018+抑制剂）（NC：阴性对照）。

第一作者简介

徐锦芳主任医师

浙江大学医学院附属第二医院

医学博士、主任医师

从事神经外科临床及科研教学等工作20余年，德国埃森大学医学院神经外科访问学者1年，科研主要方向为神经系统肿瘤的发生发展机制及治疗干预等

主持及参与浙江省自然科学基金、国家自然科学基金等各类科研项目10余项，参编著作2部，发表论文数十篇

兼任浙江省抗癌协会神经肿瘤分会青年委员会副主委，中国医师协会胶质瘤分会青年委员，浙江省医学会流行病学分会委员，浙江省科普作家协会理事，《浙江创伤外科》杂志编辑部主任等职务

通讯作者简介

张建民教授

浙江大学医学院附属第二医院

浙大二级教授、主任医师、博士生导师

浙江大学医学院附属第二医院脑科中心主任；浙江大学脑医学研究所所长；浙江大学脑机调控临床转化研究中心神经疾病分中心主任；浙江省神经系统疾病临床医学研究中心主任

浙江大学求是特聘医师，国家重点研发计划项目首席科学家，作为负责人获浙江省科技进步一等奖和中华医学科技奖二等奖等

任中华医学会神经外科分会常委兼秘书长，中国医师协会神经外科分会常委兼脑血管病专委会主委，浙江省医师协会神经外科医师分会会长，浙江省卒中学会会长等

此外，还担任《中华神经外科杂志（英文）》副总编、《NEUROSURGERY中文版》副主编兼脑血管外科分册执行主编等

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