5、由5种代谢物组成的风险预测模型对RIA的检测表现出完美的准确性。
整个研究设计的简明工作流程如图1所示。本研究共收集了105份血浆样品用于分析，其中75份来自不同状态的颅内动脉瘤（IAs）患者，30份来自对照组。处于未破裂状态的IA患者（UIAs）、处于破裂状态的IA患者（RIAs）和对照参与者的特征如表1所示。如图所示，就人口统计学因素（年龄、性别和吸烟）而言，各组之间没有显著差异。然而，对照组的高血压患病率低于疾病组，但UIA和RIA之间没有差异。此外，三组之间在其他并发症的患病率方面没有差异，如心脏病（心肌梗死和心绞痛）、高脂血症、脑卒中和糖尿病。就动脉瘤特征而言，UIA通常发生在颈内动脉，而不规则形态在放射免疫分析中更常见（表1）。
图1 颅内动脉瘤生物标志物发现的研究设计和工作流程
UIA=未破裂的颅内动脉瘤；RIA=颅内动脉瘤破裂；TOF=飞行时间；MRM=多反应监测；PCA=主成分分析；OPLS-DA=正交偏最小二乘判别分析；LASSO=最小绝对收缩与选择算子模型；ROC=受试者工作特征。
表1 研究队列的人口统计学和临床特征
*平均值±标准差，§n（%），#中位数（IQR）。
对于三组之间临床特征的差异比较，我们在连续正态分布数据的情况下采用单因素方差分析（ANOVA）。两组间的非正态分布变量用Mann-whitney检验进行分析。分类变量通过χ2检验进行比较。高血压定义为血压>140/90mmHg。心脏病定义为心肌梗塞或心绞痛病史。NA：不可用；ICA：颈内动脉；MCA：大脑中动脉；PCA：大脑后动脉；BA：基底动脉；AComA：前交通动脉；PComA：后交通动脉。a对照组、UIA和RIA间P<0.05，bUIA和RIA间P<0.05。
我们通过基于UHPLC-TQMS的亲水和疏水方法检测了总共501种代谢物。我们的结果显示质控（QC）样品聚集在一起，表明该分析方法具有一定的稳定性。此外，我们通过叠加不同样品的总离子流图（TIC）来评估方法的稳定性。结果显示，TIC图的曲线高度重叠，保留时间和峰强度一致，表明信号在整个分析过程中是稳定的。
UIA组和对照组之间的血浆代谢谱的比较
为了确定与动脉瘤形成相关的代谢物，我们首先重点研究了UIA和对照组之间的差异代谢物。我们使用OPLS-DA模型，分类结果显示UIAs和对照之间所有血浆代谢物的显著分离（图2A）。前20种VIP代谢物包括各种腺苷代谢物。接下来，我们基于两组中代谢物的倍数变化进行了单变量T检验分析，发现符合p值<0.05（FDR<0.1）和投影变量重要性（VIP）>1的代谢物共有19种，其中UIAs中11种代谢物减少，8种代谢物增加，如火山图所示（图2B）。通过比较，倍数变化排名靠前的代谢物结果显示氨基酸及其代谢物丰度上调。同时，一些苯和核苷酸的衍生物如腺苷在UIAs中普遍下降（图2C）。
此外，这19种显著改变的代谢物的聚类分析显示了热图中的组间分离情况。差异代谢物的KEGG途径富集分析表明，膦酸盐和次膦酸盐代谢的危险系数最高。我们发现主要有九种明显受干扰的代谢途径，如谷胱甘肽代谢、氨基酸和辅因子的生物合成（图2D）。
图2 区分未破裂颅内动脉瘤（UIA）患者和对照组的代谢特征
A，UIA患者和对照参与者的OPLS-DA得分图。B，UIA患者和对照组的火山图。我们将log2FC>log21.2或<-log21.2，-log10FDR>1的化合物当作差异显著代谢物。C，以log2FC表示的UIA患者和对照组之间显著不同的代谢物条形图。D，UIA患者和对照组的KEGG富集气泡图。气泡的颜色代表调整后的p值，图中标出了p<0.05的路径。气泡的大小代表计数的数量（按基因比例排序）。
RIA组和UIA组的血浆代谢谱的比较
代谢谱数据的OPLS-DA模型表明，总体血浆代谢物在IAs患者的各种状态中的含量显著不同（图3A），表明这两个疾病阶段在分子水平上具有不同的代谢谱。前20种VIP代谢物包括吲哚和花生四烯酸。通过单变量分析，我们鉴定了RIA和UIAs之间的172种差异代谢物，其中69种上调，103种下调（图3B）。所有这些显著改变的代谢物在热图中聚类良好。最高下调的倍数变化代谢物主要包括各种次生胆汁酸等（图3C）。这些差异代谢物在具有最高风险因子的6种途径中富集，包括亚油酸代谢、血管平滑肌收缩、脂肪酸代谢、膦酸盐和次膦酸盐代谢、内源性大麻素信号传导和5-羟色胺能突触（图3D）。
图3 区分破裂颅内动脉瘤（RIA）患者和UIA患者的代谢特征
A，RIA患者和UIA患者的OPLS-DA得分图。B，RIA患者和UIA患者的火山图。我们将log2FC>log21.2或<-log21.2，-log10FDR>1的化合物当作差异显著代谢物。C，以log2FC表示的UIA患者和RIA患者之间显著不同的代谢物条形图。D，RIA患者和UIA患者的KEGG富集气泡图。气泡的颜色代表调整后的p值，图中标出了p<0.05的路径。气泡的大小代表计数的数量（按基因比例排序）。
基于机器学习的RIA和UIA分类生物标志物小组的选择
在系统地定义了与UIAs和RIA相关的代谢组学谱和途径后，我们开始建立一个诊断模型，通过选择代谢物来预测UIA的存在并区分RIA和UIA。我们通过初步统计筛选后得到的代谢物仍然很多（p<0.05，FC>1.2）。为了进一步缩小候选生物标志物的范围，我们应用了一种可变选择方法来筛选重要的代谢物。变量选择是指通过统计分析的方法，从大量的自变量中选出一组对因变量有较强解释能力的自变量，这是统计推断中必不可少的一环。在本研究中，我们将所有的样本以2:1的比例随机分成训练集和验证集。我们用LASSO和随机森林选择代谢物，然后将它们的交集作为候选代谢物，这些代谢物可作为最佳生物标志物。为了提高预测性能并避免过度拟合和假阳性，我们对训练集进行了500次特征选择和10次交叉验证。基于最优生物标志物，我们使用Logistic回归进行最终模型构建，并通过ROC曲线的曲线下面积（AUC）值和验证集的预测精度进行评估（图4A）。
图4 预测UIA存在和区分RIA与UIA的潜在生物标志物小组
A，综合机器学习方法鉴定生物标志物的工作流程；B，训练集中鉴别UIAs患者和对照组参与者的潜在血浆代谢物生物标志物的ROC曲线；C，验证集中鉴别UIAs患者和对照组参与者的潜在血浆生物标志物的ROC曲线；D，散点图显示模型在区分UIA患者和对照组参与者方面的预测性能。在训练集和验证集数据的基础上，我们使用Logistic回归建立最优生物标志物模型。横坐标为样本的实际群体，纵坐标为模型预测样本群体的可能性。虚线是0.5的极限值。E，训练集中鉴别RIA患者和UIA患者的潜在血浆代谢物生物标志物的ROC曲线。F，验证集中鉴别RIA患者和UIA患者的潜在血浆代谢物生物标志物的ROC曲线。G，散点图显示模型在区分RIA患者和UIA患者时的预测性能。
通过利用上述机器学习策略，我们确定了一个诊断小组，用以预测是否发生UIA（UIA vs.对照），该小组包含六种代谢物（M6），包括N-乙酰-L-亮氨酸，胆色素原，水杨酸乙酯，乙硫氨酸，N6-甲基腺苷和1-甲基腺苷。该诊断模型可以高灵敏度和特异性将UIA与对照区分开，其AUC在训练组中为0.9（图4B），在验证组中为0.843（图4C），在所有样品中为0.882。该模型的预测效果通过散点图来呈现，以评估机器学习策略的可靠性，结果表明，在验证集上，不同的样本可以以19/24的高精度被正确分类（图4D）。
我们进一步探索了区分IA患者不同状态的可能性（RIA与UIA）。在两种机器学习方法中具有相似性能的最佳生物标志物或破裂预测模型由五种代谢物（称为M5）组成，包括甘氨鹅去氧胆酸、5,6-二甲基苯并咪唑、尿嘧啶、儿茶酚和N-（1-脱氧-1-果糖基）苯丙氨酸。区分RIA和UIA的破裂预测模型在训练集中产生了0.99的AUC（图4E），在验证集中产生了0.929的AUC（图4F），在所有样品中产生了0.933的AUC。散点图显示了RIA组和UIA组的模型的良好预测效果，精确度为23/25（图4G）。
最后，诊断模型中M6的丰度在训练集和验证集上都显示出统计学显著性，暗示它们作为区分UIA的生物标志物的潜力（图5A）。虽然大多数生物标志物在破裂预测模型中也显示出一致的显著差异，但是甘氨鹅去氧胆酸和5,6-二甲基苯并咪唑仅在RIA的验证集中显示出下降趋势（图5B）。
图5 训练集和验证集中潜在生物标志物的相对含量变化A，UIAs患者和对照组患者中M6生物标志物的箱线图。B，RIA患者和UIA患者中M5生物标志物的箱线图。
在这里，我们进行了一项拟靶向代谢组学研究，以系统地定义代谢谱和IA发展中的相关途径。代谢组学图谱分析显示，与对照组参与者相比，UIAs患者中存在差异显著的途径，其中谷胱甘肽代谢出现最显著的改变。此外，两条途径似乎在从UIA到放射免疫反应的过程中起着至关重要的作用。我们开发了一种全面的生物标志物发现策略，以进一步选择和验证两个生物标志物小组，分别包含6种和5种代谢物。这些组合具有潜在的临床实用性，并可通过结合两种机器学习算法（LASSO和随机森林）对UIA及其破裂状态进行分类。这两种算法越来越被视为评估和预测疾病状态的有效方法。血浆生物标志物小组将UIAs与对照区分开，具有非常高的性能，在训练组中AUC为0.9，在验证组中为0.843。更重要的是，我们开发了一种基于五种代谢物的预测模型，以区分来自UIA的RIA患者，具有很高的有效性：训练集和验证集中的AUC分别为0.99和0.929。我们的发现强调了特定代谢物作为IA新的早期诊断和风险生物标志物的作用。我们选择的代谢物获得了极好的诊断和预测能力。ROC曲线表明潜在的生物标志物组将适用于IAs的诊断和破裂风险评估。
由于无症状携带率高，颅内动脉瘤会引发高发病率和死亡率，并在破裂后对神经系统造成损害。尽管数字减影血管造影（DSA）目前是IAs诊断和风险评估的黄金标准，但由于健康风险、成像解释的主观变化和成本，在大规模人群筛查中进行定期和重复的侵入性检查具有挑战性。因此，在这方面，人们迫切需要建立和验证具有高特异性和准确性的生物标志物，用于IA破裂风险的早期诊断、动态监测和评估。随着技术的快速发展，代谢组学越来越多地用于定义疾病，特别是心血管疾病的预测性生物标志物，并越来越多地成为理解疾病病理生理机制的工具。我们的研究提供了IA患者整个代谢谱的综合轮廓，并确定了其检测和风险评估的潜在生物标志物，从而更好地了解IA的病理过程。
本研究有几个值得注意的发现。代谢谱分析显示，与对照组相比，UIA患者的代谢途径发生了显著改变，其中谷胱甘肽代谢出现了最显著的失调。最近的研究表明，谷胱甘肽代谢的上调可以增加活性氧（ROS）的产生，这在IAs的发病机理中起着至关重要的作用。它还增强血管内皮生长因子受体2（VEGFR2）的激活，VEGFR2是血管生成的基本调节因子，在血管平滑肌细胞表型转化中起重要作用。相应地，我们的研究表明甘氨酸和L-鸟氨酸在UIA患者中通过这种途径显著增加。因此，我们假设这些氨基酸代谢物可能通过氧化应激促进IA的形成。先前的研究已经发现未破裂动脉瘤患者的氨基酸和脂肪酸存在显著的代谢异常。我们的发现与此一致，但我们的结果进一步表明，脂肪酸代谢主要促成了IA的进展阶段。随着IA的加重，亚油酸代谢途径和血管平滑肌收缩途径被显著富集。具体来说，花生四烯酸在这两条途径中都起着至关重要的作用。最近的研究发现，花生四烯酸代谢产物促进动脉粥样硬化的发生、发展和斑块不稳定性，是IA的危险因素。因此，我们有理由推测花生四烯酸在IA的进展中起作用。此外，众所周知血管平滑肌细胞的表型转化在IA进展中起重要作用。在我们的研究中，存在着血管平滑肌收缩途径的特征性富集，并伴随着腺苷含量的降低。同时，甲基化修饰的腺苷，如N6-甲基腺苷和1-甲基腺苷，可作为诊断模型的生物标志物，在UIA也显著下调。因此，我们假设这些代谢物可能与降低血管平滑肌收缩性有关。
在RIA和UIA之间具有最高倍数变化的代谢物中，我们发现各种甘氨酸结合的次级胆汁酸显著减少，其中甘氨鹅去氧胆酸也是破裂预测模型中的生物标志物。先前的动物和人类研究表明，肠道微生物菌群的改变会导致颅内动脉瘤的破裂。我们的研究表明，次级胆汁酸可能介导肠道菌群失调对IAs的致病作用，这需要在未来的研究中进一步证实。随后，尿苷和尿嘧啶随着IA及其破裂而动态减少。尿苷在中枢神经系统中起着至关重要的作用，尿苷给药具有抗癫痫作用。因此，一项大规模全基因组关联研究（GWAS）中的药物靶向富集显示了抗癫痫药物的多效性特征与颅内动脉瘤的遗传相关性。因此，我们的研究提出了尿嘧啶核苷对动脉粥样硬化有潜在治疗作用的可能性。
我们的研究也有一些局限性。首先，它是在小规模队列中进行的，并且没有在前瞻性队列研究中得到充分验证。因此，我们需要大规模、多中心的临床试验来评估这两个小组作为IAs非侵入性生物标志物的精确性和稳健性。其次，考虑到动脉瘤破裂事件本身也会引起机体的应激反应，一些在破裂组中发生显著变化的代谢物只能指示破裂后状态而不能作为风险预测指标。然而，参与颅内动脉瘤病理过程的代谢物在破裂风险预测方面仍具有基础性的应用前景，其作用机制值得未来需通过基础实验进一步验证。第三，其他可能影响IAs的危险因素在我们的研究中没有涉及，包括基因和血液动力学参数。此外，生物标志物代谢物在IA发病机制中的详细作用需要进一步阐明或实验验证。总之，我们的结果提供了与IA相关的代谢组学数据集，并确定了其检测和风险评估的潜在生物标志物，可以帮助人们更好地理解IA的病理过程。这些预测模型证明了代谢标志物作为IA及其破裂的非侵入性风险诊断工具的潜力，这可能对IA的临床评估和管理产生深远的影响。
通讯作者简介
孙海涛 副主任医师
南方医科大学珠江医院
外科学（神经外科）博士，副主任医师、副研究员，硕导（神经外科学）
南方医科大学珠江医院临床生物样本资源中心主任
主要研究方向：脑重大疾病（出血性脑血管病、脑肿瘤等）基础与临床转化研究
学术任职：中国神经科学学会神经损伤与修复分会委员、中国研究型医院学会细胞外囊泡研究与应用专业委员会委员、中国医药生物技术协会组织生物样本库分会委员、广东省人类遗传资源保藏应用学会副会长兼理事等。任Stroke & Vascular Neurology、ACS Chemical Neuroscience、Journal of Inflammation Research等期刊审稿专家。
作为项目负责人承担包括国家自然科学基金（青年1项）、广东省自然科学基金（3项）、香港HMRF等7项科研课题。以一作/通讯作者发表SCI收录文章10余篇，包括Cell Research、CNS Neuroscience & Therapeutics、Current Neuropharmacology、Molecular Neurobiology、Clinica Chimica Acta、Cancers等。获国家授权专利1项，申请国家发明专利4项。曾获选“香江学者计划”、“广州市珠江科技新星”、“广东省100位博士博士后创新人物”等人才项目及荣誉称号。
段传志 主任医师
南方医科大学珠江医院
二级教授、主任医师、博士（后）导师
南方医科大学珠江医院脑血管病中心主任、介入治疗中心主任
主要研究方向：脑血管疾病遗传基因学研究，颅内动脉瘤形成和破裂出血的血流动力学研究以及蛛网膜下出血后早期脑损伤的机制研究。
主要学术任职：广东省医学会神经介入学分会首任主任委员、广东省医师协会神经介入医师分会首任主任委员、广东省临床医学学会介入神经病学专业委员会名誉主委、广东省颅脑外科医疗质量控制中心副主任、广东省介入放射质量控制中心副主任、中国医师协会神经介入专业委员会第二届委员会副主任委员、中国人体健康科技促进会临床神经科学技术转化专委会副主任委员、国家卫计委出血性卒中介入治疗专业委员会副主任委员、国际血管联盟中国分部脑血管病委员会副主任委员、广东省医师协会神经外科分会副主任委员、广东医学会介入医学分会副主任委员、广东省介入放射医师协会副主任委员、Journal of NeuroInterventional Surgery（JNIS）杂志中文版副主编。
科研成果：主持国家“十一五”攻关课题、十三五重点研发计划项目、国家自然基金、广东省自然科学基金、广东省科技计划等重大项目多项；发表SCI论文100余篇，获专利2项，主编专著3部（《实用介入神经放射学》、《颅内动脉瘤血管内治疗学》、《颅内动静脉畸形》），参编专著7部。先后指导硕士及博士研究生、博士后超百名。
获奖：广东省科学技术一等奖1项；省部级科技及医疗成果二等奖6项；省部级科技及医疗成果三等奖7项；2009年获广东省第十届丁颖科技奖；2018年获首届广东医师奖及首届珠江医院医师奖；羊城好医生。
广东省卫生健康委广东医学领军人才、华南脑血管疾病介入领军人才，2010-2011年担任中国医师代表团团长意大利锡耶纳综合大学访问学者。长期从事神经外科临床医疗、教学、科研、管理工作，行血管内介入治疗10000余例，疗效显著，尤其擅长颅内动脉瘤、脑（脊髓）血管畸形、硬脑（脊）膜动静脉瘘、颈内动脉海绵窦瘘、脑血管狭窄与闭塞等中枢神经系统疾病的血管内治疗。率先在华南地区开展血流导向装置治疗复杂颅内动脉瘤以及静脉入路栓塞脑动静脉畸形等国内领先技术。每年完成颅内及脊髓血管性疾病治疗超千台，是华南地区首位血流导向装置植入金牌导师。
石遵计
青年研究员
兰州大学草地微生物研究中心/草地农业科技学院
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