Nat Commun两文齐发丨程田林/仇子龙/赵兴明合作实现TadA及同源蛋白筛选改造与高精度迷你碱基编辑器的开发 - 脑医汇 - 神外资讯

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人类遗传病的所有致病遗传变异中，超过60%都是单碱基点突变¹，但如何高效精准的诱导及修复致病点突变以开展功能及治疗探索长期困扰着领域内的研究者。2016年以来，哈佛大学David Liu实验室将碱基脱氨基酶与CRISPR-Cas9系统有机组合，开发出了可实现目标碱基高效精准替换的新型编辑系统——碱基编辑器。根据脱氨基酶的不同，可分为胞嘧啶脱氨基酶AID/APOBEC为核心、可实现C·G--T·A碱基对高效转换的胞嘧啶碱基编辑器（CBE），与蛋白定向演化后的腺嘌呤脱氨酶TadA为核心、可实现A·T--G·C碱基对高效转换的腺嘌呤碱基编辑器（ABE）^2-3。碱基编辑器CBE和ABE的出现为点突变功能研究和人类遗传病治疗研究带来了巨大的变革，也开启了碱基编辑器工具研发的热潮。

随着研究的深入，早期碱基编辑器的的多种缺陷与不足也引起了研究者的关注与重视。其中CBE会导致非常严重的Cas9非依赖型DNA脱靶风险^4-5，因此需要更进一步的改进和优化。最近研究还发现，TadA突变体进行蛋白工程化改造可以让碱基编辑器ABE变身ACBE或CBE，这为碱基编辑器CBE的构建提供了新的思路^6-12。然而现有碱基编辑器ABE及其衍生工具的脱氨基酶均源自大肠杆菌的TadA（ecTadA），其它物种来源TadA同源蛋白在碱基编辑器开发中的潜力目前仍缺少研究。此外，传统碱基编辑器体积巨大，难以通过单一AAV病毒系统进行有效的体内递送，这也极大的限制了碱基编辑器的应用潜力。

2023年1月26日，来自复旦大学脑科学转化研究院的程田林实验室在Nature Communications杂志上发表了题为TadA orthologs enable both cytosine and adenine editing of base editors的论文。文章对其它物种的TadA同源蛋白系统性的改造与筛选，发现有25种TadA同源蛋白可通过单/双点突变改造构建出功能性的ABE、CBE或ACBEs。本研究首次证实TadA同源蛋白可通过简单的蛋白质工程化改造开发出多样化的碱基编辑器，为碱基编辑器的未来优化与改造提供了更多思路。

程田林团队的前期工作证实nCas9的内部融合可增强碱基编辑器ABE的编辑活性并拓展活性窗口。本研究中程田林团队发现，大肠杆菌来源的野生型ecTadA添加5’-NLS和3’-柔性接头序列并融合于nCas9内部的DS1249位点后，仅通过A106V和D108N双点突变便可获得具有明显腺嘌呤和胞嘧啶编辑活性的功能性碱基编辑器1249-NL-ecTadA（VN），其A5的A-G突变率为83%，C4的C-T突变率为27%。

在此基础上，研究团队对近千种TadA同源蛋白进行了系统进化树分析，并挑选>50种其它物种来源的TadA同源蛋白进行类似的改造和功能筛选。结果发现有25种TadA同源蛋白可通过单/双点突变改造生成功能性的ABEs、CBEs和ACBEs（图1）。随后研究团队挑选数种有代表性的TadA同源蛋白衍生碱基编辑器进行安全性评估，发现其Cas9非依赖的DNA脱靶效应极低，而RNA脱靶效应在合理的点突变设计后有明显降低甚至接近本底水平。

图1 TadA同源蛋白改造用于功能性ABEs、CBEs和ACBEs的构建

总体而言，程田林研究团队提供了TadA同源蛋白通过简单蛋白质工程化改造（单/双点突变）用于碱基编辑器开发的新思路，并证实了TadA同源蛋白用于包括ABE、CBE以及ACBE在内的各类碱基编辑器开发的可行性。该研究为碱基编辑器的开发提供了一种新的替代和简化策略，这对于开发具有独特编辑特性的碱基编辑器有非常重要的指导意义，也为脱氨基酶的潜在演化过程提供了思路。

复旦大学脑科学转化研究院程田林实验室的张淑倩博士、中科院脑科学与智能技术卓越创新中心（神经科学研究所）袁博博士为该研究论文的共同第一作者。复旦大学脑科学转化研究院陈金龙博士、邱佳怡，复旦大学类脑智能科学与技术研究院曹际新、宋利婷博士对本研究亦有重要贡献。本项目得到了复旦大学类脑智能科学与技术研究院赵兴明教授、陈靖祺博士，以及中科院脑科学与智能技术卓越创新中心（神经科学研究所）仇子龙研究员的大力支持。

此外，Nature Communications杂志同时发表了复旦大学脑科学转化研究院程田林实验室、复旦大学类脑智能科学与技术研究院赵兴明实验室与中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心/上海交通大学医学院松江研究院仇子龙实验室合作的题为TadA reprogramming to generate potent miniature base editors with high precision的论文。

文章通过各类脱氨基酶与迷你CRISPR-Cas12f系统的组合筛选，首次开发出功能性的miniCBEs和具有全新活性窗口的miniABEs。此外，文章还对高活性脱氨基酶突变体TadA-8e的关键位点进行饱和突变筛选，实现了碱基编辑器ABE向ACBE和CBE的转变，并在此基础上开发出了具有单碱基编辑精度的miniCBEs工具。

本研究系统性探索了迷你碱基编辑器的开发策略并验证了体内编辑的有效性，为迷你碱基编辑器的未来优化与改造奠定了基础。

复旦大学脑科学转化研究院张淑倩博士、张成博士，中科院脑科学与智能技术卓越创新中心（神经科学研究所）袁博博士，复旦大学类脑智能科学与技术研究院宋利婷博士、曹际新博士为该研究论文的共同第一作者。复旦大学脑科学转化研究院陈金龙博士、邱佳怡对本研究亦有重要贡献。本研究得到了复旦大学脑科学研究院邰一琳研究员，复旦大学类脑智能科学与技术研究院陈靖祺博士的大力支持。

课题组招聘

程田林课题组目前有青年副研究员、特任副研究员和博士后的岗位，欢迎对基因编辑技术研发和脑疾病治疗感兴趣的科研人员/同学加入。

申请人请提供一份详细的个人完整简历（中英文皆可），应聘理由请注明姓名+应聘职位。

简历投递（有意者请将个人简历等材料发至）：https://jinshuju.net/f/ZqXwZt

原文链接：

https://doi.org/10.1038/s41467-023-36003-3

https://doi.org/10.1038/s41467-023-36004-2

参考文献（上下滑动查看）：

1. Rees HA, Liu DR. Base editing: Precision chemistry on the genome and transcriptome of living cells. Nat Rev Genet,2018, 19: 770-788
2. Komor, A., Kim, Y., Packer, M. et al. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature 533, 420–424 (2016).
3. Gaudelli, N.M. et al. Programmable base editing of A*T to G*C in genomic DNA without DNA cleavage. Nature 551, 464-471 (2017).
4. Zuo E, Sun Y, Wei W, Yuan T, et al. Cytosine base editor generates substantial off-target single-nucleotide variants in mouse embryos. Science. 2019 Apr 19;364(6437):289-292.
5. Jin S, Zong Y, Gao Q, et al. Cytosine, but not adenine, base editors induce genome-wide off-target mutations in rice. Science. 2019 Apr 19;364(6437):292-295.
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11. Chen, L., Zhu, B., Ru, G. et al. Re-engineering the adenine deaminase TadA-8e for efficient and specific CRISPR-based cytosine base editing. Nat Biotechnol (2022).
12. Neugebauer, M.E., Hsu, A., Arbab, M. et al. Evolution of an adenine base editor into a small, efficient cytosine base editor with low off-target activity. Nat Biotechnol (2022).

来源：BioArt

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