Nat Methods丨田禾等报道基于光学混合筛选技术的远红外膜电位探针优化

排版 | AiBrain 编辑团队

膜电位成像是近年来神经科学内快速发展的前沿技术之一。与经典的膜片钳技术相比，荧光膜电位成像具有操作简单、高通量、可遗传编码的特点，对研究活体内电生理现象有独特优势。

在各种可遗传编码的膜电位荧光探针（genetically encoded voltage indicators, GEVIs）中，哈佛大学Adam Cohen课题组发展的基于Archaerhodopsin3的膜电位探针具有最红移的光谱¹。2014年， Cohen实验室提出了“全光学电生理技术”的概念²。Cohen实验室构建了红移的膜电位荧光探针和蓝移的光敏感通道（channelrhodopsin）的共表达载体并将其表达在神经元中，然后用蓝光激发神经元的动作电位，同时在远红外荧光通道中记录膜电位的变化。2019年，Cohen实验室发表的Nature论文首次报道了对小鼠海马体CA1区域的膜电位成像记录³。

和广为使用的钙探针GCaMPs相比，可遗传编码的膜电位探针有若干天然“劣势“。首先，膜电位探针必然基于膜蛋白，而胞质内比细胞膜上可容纳更多的探针分子数。其次，由于动作电位的持续时间在毫秒级别，而钙信号的变化时间在百毫秒级别，膜电位成像的单位曝光时间远低于钙成像。换言之，膜电位成像的光子预算（photon budget）受到更大限制。基于Archaerhodopsin3的膜电位探针的荧光来自蛋白内部的视黄醛（retinal）基团。这种探针虽然有很高的膜电位敏感度，但其较低的量子产率影响了单位时间内可收集的光子数量，进而限制了探针的信噪比（signal-to-noise ratio）。而在活体内全光学电生理记录实验中，探针的信噪比可谓“锱铢必较”、“多多益善”。因此在Cohen实验室报道了基于Archaerhodopsin3的膜电位探针后，加州理工的Frances Arnold和Viviana Gradinaru课题组⁴与麻省理工的Ed Boyden课题组⁵曾先后试图利用定向进化的方法改进这类膜电位探针的表现。

生物探针的定向进化是改进探针性质的重要手段，也是主要实验瓶颈之一。根据既往经验，由膜蛋白改造的探针，往往要在哺乳动物细胞上表达才有正常功能。即使可以在原核细胞中表达，经过数轮定向进化后，得到的产物可能反而无法在哺乳动物细胞中正常折叠——这样的探针对神经学研究毫无意义。在活体成像中，荧光探针的表现由亮度、灵敏度、响应速度等多个指标共同决定。因此探针突变体的筛选必须基于动态光学信号，综合考虑多个指标。目前大部分致力于荧光探针定向进化的课题组都采用了显微荧光成像结合阵列筛选的方法。一般而言，实验人员需要构造数千个突变体质粒，并将其逐一表达在96或384孔板中。这种方法需要大量的重复性操作，费时费力且效率低下。

2023年1月9日，来自哈佛大学Adam Cohen教授和田禾博士后研究员在Nature Methods上发表题为Video-based pooled screening yields improved far-red genetically encoded voltage indicators的研究论文。

这篇论文报道了最新一代基于Archaerhodpsin3的膜电位探针的筛选、表征及其在活体小鼠大脑中的应用示范。

图1

为解决荧光探针筛选的通量瓶颈问题，作者首先发展了一种基于动态光学信号的混合筛选系统（图1）。与阵列筛选相比，混合筛选文本库的构建和表达远为简易廉价。这套系统由两个要素组成：1）超大视野、可同时表征数千个文本库细胞的荧光显微成像系统；2）在显微镜下进行光学标记的新方法Photopick。

为筛选膜电位探针，作者对野生型HEK293细胞系进行了遗传改造，通过共表达电压门控性钠通道NaV1.5和内向整流钾通道Kir2.1，得到了一种具有电生理兴奋性的spiking HEK细胞⁶。

作者继而用慢病毒递送系统，将1）单个膜电位探针突变体及2）一种可以在紫光（405nm）光照下变色的荧光蛋白mEOS4a稳定表达在spiking HEK细胞中。在光学筛选流程中，作者首先测量在成像视野中的数千个突变文库细胞的膜电位探针信号，并用数字微镜器件（digital micromirror array device，DMD）将紫光准确投射到兼有亮度和响应度的的细胞上。在紫光照射后，mEOS4a由绿色转变为红色。作者随后用流式细胞仪将红色的细胞回收，在培养皿中扩增后细胞后重复上述的筛选流程。在这个过程中，有利的突变会被不断富集。最后作者用Illumina测序分析被点突变的丰度变化，从而确定可以增强膜电位探针的点突变。

根据混合筛选得到的点突变，作者获得了最新一代的远红外膜电位探针QuasAr6a和QuasAr6b。其中QuasAr6a对膜电位的变化具有更高的灵敏度，而QuasAr6b具有更快的响应速度。作者与位于马塞诸塞州剑桥市的生物技术初创企业Q-State合作（Adam Cohen为Q-State创始人之一），在体外大鼠海马原代神经元中将新探针QuasAr6a/b与上一代探针Archon1 ⁵进行了高通量、头对头的比较。结果证明在体外培养的神经元细胞中，QuasAr6a/b的亮度、信噪比、响应速度这几个关键指标都得到了提高。

作者进一步比较了在小鼠活体神经元膜电位成像中QuasAr6a/b与Archon1的表现。由于不同类型的神经元的动作电位往往具有不同的特性（如阈值、幅度、半峰宽），而这些电生理信号的不同会影响光学信号的强度。作者利用了Cre工具小鼠品系，在大脑皮层表面的Neuron Derived Neurotrophic Factor（NDNF）细胞中比较了QuasAr6a,QuasAr6b和Archon1，同时在海马体CA1区域的Parvalbumin（PV）细胞中比较了QuasAr6b和Archon1。结果表明，在NDNF细胞中表达的QuasAr6a比Archon1具有更高的信噪比。而在PV细胞中，QuasAr6b在信噪比和响应速度上都超过Archon1。由于PV细胞的动作电位半峰宽（<0.5ms）显著窄于NDNF细胞的动作电位半峰宽，因此对捕捉快速电生理信号，响应速度更快的QuasAr6b更有优势。

膜电位探针信噪比的提高意味着在活体内记录多个神经元的电信号更加容易。作者利用QuasAr6a/b与蓝光激发的光敏感通道CheRiff的Optopatch组合，发展了在活体小鼠脑内探测神经元连接的全光学电生理方法。神经元可以通过化学突触（chemical synapse）和电突触（electrical synapse）两种方式连接。化学突触需要神经递质转导，而电突触则依靠连接蛋白构成离子通道，直接扩散电信号。如果用经典的电生理技术研究活体生物内的神经元连接，研究人员需要用膜片钳同时记录两个神经元，这项操作需要相当精细的手艺和丰富大的经验，难度大，失败率高。作者证明，用新一代的Optopatch组合，可以定量分析大脑皮层表明NDNF细胞之间的抑制性突触连接强度，和海马区PV细胞之间的电突触连接强度。值得注意的是，作者发现PV细胞之间的电突触往往是不对称的。在这个两个实验中，作者记录的NDNF和PV神经元均超过了二十对，体现了光学记录的通量优势。

此外，在2022年哈佛医学院Bernardo Sabatini实验室发表的eLife论文中⁷，QuasAr6a被用于追踪大脑切片中神经元远端树突的电位变化。

综上所述，这项研究发展了一种更简便易行的高通量光学筛选平台，并利用这个平台对膜电位探针进行了优化。

最新一代的膜电位探针可以用来定量分析活体小鼠大脑内的神经元连接，推动了全光学电生理技术的发展。

原文链接：

https://doi.org/10.1038/s41592-022-01743-5

参考文献（上下滑动查看）：

1. Kralj, J.M., Douglass, A.D., Hochbaum, D.R., Maclaurin, D. & Cohen, A.E. Optical recording of action potentials in mammalian neurons using a microbial rhodopsin. Nat. Methods 9, 90-U130 （2012）.
2. Hochbaum, D.R., Zhao, Y., Farhi, S.L., Klapoetke, N., Werley, C.A., Kapoor, V., . . . Cohen, A.E. All-optical electrophysiology in mammalian neurons using engineered microbial rhodopsins. Nat. Methods 11, 825-833 （2014）.
3. Adam, Y., Kim, J.J., Lou, S., Zhao, Y., Xie, M.E., Brinks, D., . . . Cohen, A.E. Voltage imaging and optogenetics reveal behaviour-dependent changes in hippocampal dynamics. Nature 569, 413-417 （2019）.
4. McIsaac, R.S., Engqvist, M.K.M., Wannier, T., Rosenthal, A.Z., Herwig, L., Flytzanis, N.C., . . . Arnold, F.H. Directed evolution of a far-red fluorescent rhodopsin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 111, 13034-13039 （2014）.
5. Piatkevich, K.D., Jung, E.E., Straub, C., Linghu, C., Park, D., Suk, H.J., . . . Boyden, E.S. A robotic multidimensional directed evolution approach applied to fluorescent voltage reporters. Nat. Chem. Biol. 14, 352-360 （2018）.
6. Park, J., Werley, C.A., Venkatachalam, V., Kralj, J.M., Dib-Hajj, S.D., Waxman, S.G. & Cohen, A.E. Screening fluorescent voltage indicators with spontaneously spiking HEK cells. PLoS One 8, e85221 （2013）.
7. Landau, A.T., Park, P., Wong-Campos, J.D., Tian, H., Cohen, A.E. & Sabatini, B.L. Dendritic branch structure compartmentalizes voltage-dependent calcium influx in cortical layer 2/3 pyramidal cells. eLife 11 （2022）.

来源：BioArt

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