撰稿 | 随艺
排版 | AiBrain 编辑团队
阿尔茨海默病（AD）是痴呆最常见的原因，是一种进行性神经退行性疾病，临床上明显存在记忆缺陷。除了淀粉样蛋白假说之外，脑血管功能障碍，尤其是血脑屏障（BBB）损伤，在AD进展中的参与也越来越受到重视。以前的研究表明，运动通过恢复紧密连接（TJs）的表达和在衰老过程中保持周细胞的功能和几种慢性炎症性疾病（如多发性硬化症）来减轻BBB功能障碍。然而，运动是否可以改善AD病理学中的BBB损伤及其机制尚不清楚。
最近，外泌体作为细胞间通讯的关键介质，在运动中受到了密切关注。越来越多的研究表明，它们在运动期间的释放可以通过介导生物活性分子（包括蛋白质、脂质、mRNA和非编码RNA）的水平转移（例如miRNA）以“内分泌方式”起作用，从而影响受体细胞功能。
2022年12月9日，山东大学附属省立医院的杜怡峰课题组在aging cell上发表了题为“Exosomal miR-532-5p induced by long-term exercise rescues blood–brain barrier function in 5XFAD mice via downregulation of EPHA4”的研究文章，该结果表明，大脑释放的外泌体含有特定的miRNA，该miRNA通过运动改变，并对AD中的血脑屏障功能产生影响。
首先，作者通过跑步机训练（图1a）、水迷宫（图1b）和八臂放射迷宫评估了小鼠的记忆能力，结果显示，EXE-5XFAD小鼠具有更多的探索意识。通过逃避潜伏期测试发现EXE-5XFAD小鼠的逃避潜伏期显著缩短了（图1c）。在空间探索实验中，结果显示，EXE-5XFAD小鼠的路线轨迹是有目标的（图1b），并且EXE-5XFAD小鼠的平台交叉次数显著高于SED-FAD小鼠(图1d)。除了空间记忆之外，作者还观察到， EXE-5XFAD小鼠的工作记忆和参考记忆错误的频率显著较低（图1e）。
为了研究运动是否在体内通过血脑屏障清除Aβ中发挥作用，作者在WT小鼠（静态和运动）中研究了人类Aβ-42的清除。结果显示，与SED-WT小鼠相比，在脑内给予人Aβ42后30分钟，EXE-WT小鼠的Aβ42脑内滞留较低（图1f）。与这些结果一致，与对照组相比，运动使通过BBB的Aβ42外流增加了（图1g）。此外，作者还发现，与SED-WT小鼠相比，EXE-WT小鼠的血浆Aβ42水平较高，证实Aβ从脑清除至血液的情况改善（图1h）。
图1：在5XFAD小鼠中，长期运动可改善脑内Aβ通过血脑屏障的清除，并减轻记忆能力。
接下来，作者研究了长期运动是否通过外泌体影响BBB功能。作者首先分离了运动和久坐的小鼠脑组织中的外泌体，通过电镜观察其直径约50~150nm（图2a）。通过NTA确定粒径分布（图2b）。蛋白质印迹分析显示，分离的囊泡表达知名的外泌体标志物，但不表达内质网蛋白calnexin（图2c,d）。
接着作者用用脂质结合的荧光染料PKH26标记外泌体证实了外泌体被受体细胞内化，然后将原代周细胞和内皮细胞暴露于AβO（3μM）24 h后，分别在培养基中加入PBS、exo和SED-5XFAD小鼠的外泌体（SED-exo）培养48h，WB结果显示EXE-exo+ AβO组PDGFRβ、NG2和ZO-1的表达都增加了（图2f、g）。MTT分析显示，EXE-exo增加了周细胞和内皮细胞的增殖（图2h,i）。与SED-exo相比，EXE-exo也降低了AβO诱导的周细胞和内皮细胞凋亡（图2j-l）。
图2：EXE-5XFAD小鼠脑外泌体的特征和功能验证。
紧接着，作者进一步探索了运动后外泌体miRNA的变化。根据之前的报道，作者选择了5个候选miRNA，通过RT-qPCR分析进一步筛选发现，在这5个miRNA中，只有miR-532-5p在运动小鼠和静坐小鼠的脑源性外泌体中存在差异表达（图3a）。
此外，作者分别用EXE-exo和SED-exo处理原代周细胞和内皮细胞，结果显示EXE-exo组中miR-532-5p的含量显著高于SED-exo组（图3b,c）。将miR-532-5p抑制剂EXE-exo加入AβO预处理细胞48h后，WB分析显示，转染miR-532-5p mimics导致PDGFRβ和ZO1的表达增加，与EXE-exo的作用相似。相反，与EXE-exo和miR-532-5p抑制剂共培养的细胞中，PDGFRβ和ZO1的表达显著降低（图3d）。同时检测细胞凋亡和增殖情况。结果显示，miR-532-5p抑制剂降低甚至消除了EXE-exo的积极作用（图3e-i）。
为了进一步证明miR-532-5p在血脑屏障功能中发挥重要作用，作者在体内过表达miR-532-5p。给药后5周，与对照相比，5XFAD小鼠脑内miR-532-5p过表达使PDGFRβ、NG2、ZO-1和LRP1的表达显著增加（图3j）。
图3：miR-532-5p对BBB具有保护作用。
接下来作者检测了miR-532-5p在小鼠肾脏、肝脏、肌肉和大脑中的表达。总体而言，miR-532-5p在多种组织中表达，但在脑内的表达量最多，这提示miR-532-5p更有可能起源于脑（图4a）。此外，在5XFAD小鼠中，运动诱导miR-532-5p最显著增加的是大脑，这进一步证实大脑是miR-532-5p的主要来源（图4b,c）。
为了进一步验证这一点，作者应用RNA显色原位杂交（CISH）技术来观察miR-532-5p在全脑中的表达。结果显示，AD导致miR-532-5p表达显著降低（SED-5XFAD vs SED-WT）。大脑中MiR-532-5p在EXE-5XFAD小鼠中的表达比在SED-5XFAD小鼠中的表达高，表明运动提高了5XFAD小鼠全脑中MiR-532-5p的表达（图4d,e）。
图4：长期运动可增加神经元中miR-532-5p的表达。
作者将三个不同数据库（starbase、miRDB和TargetScan）的基因列表取交集，共提取出31个miR-532-5p的靶基因。先前的研究表明在AD人脑中Eph受体A4（EphA4）的活性水平升高，因此，作者最后将重点放在EPHA4上进行进一步分析。双荧光素酶报告实验验证miR-532-5p与EPHA4的3 ' UTR的结合关系，结果显示miR-532-5p模拟物降低了假定靶基因的荧光素酶活性，而EPHA4内假定miR-532-5p结合位点突变的荧光素酶活性无显著差异（图5a）。此外，与对照组相比，脑内miR-532-5p的过表达导致5XFAD小鼠和WT小鼠的EphA4水平降低（图5b,c）。
在证明EPHA4受miR-532-5p的直接抑制控制后，作者采用小干扰RNA（siRNA）沉默EPHA4的表达研究了EPHA4是否可以影响周细胞和内皮细胞中功能蛋白的表达。结果显示，原代周细胞中的PDGFRβ和原代内皮细胞中的ZO-1水平升高，表明EPHA4表达可影响这些细胞的功能（图5d,e）。在长期运动后，作者检测到EXE-5XFAD小鼠中EphA4的表达下降（图5f,g）。
图5：EPHA4是miR-532-5p的靶基因。
综上所述，本研究表明，长期运动会触发大脑释放外泌体，携带增加的miR-532-5p水平，诱导BBB中的基因表达变化，从而改善AD中的BBB功能。这些结果表明，通过外泌体miR-532-5p改善BBB的功能可能是AD的潜在治疗策略。
参考文献：
Liang X, Fa W, Wang N, et al. Exosomal miR-532-5p induced by long-term exercise rescues blood-brain barrier function in 5XFAD mice via downregulation of EPHA4 [published online ahead of print, 2022 Dec 9]. Aging Cell. 2022;e13748. doi:10.1111/acel.13748
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