德国海德堡癌症研究中心的Michael Platten等通过纵向单细胞图谱定义IDH突变型胶质瘤中的髓细胞状态，并证明其受肿瘤基因型的严格控制，文章发表在2021年7月的《Nature Cancer》杂志。
——摘自文章章节
【Ref: Friedrich M, et al. Nat Cancer. 2021 Jul;(2)723-740. doi: 10.1038/s43018-021-OO201-z.】
胶质瘤微环境与肿瘤的演化、进展和治疗耐药性密切相关。在高级别胶质瘤（HGG）中，小胶质细胞和单核细胞来源的巨噬细胞统称为胶质瘤相关髓细胞（glioma-associated myeloid cells，GAM），占肿瘤的70%。目前的观点认为，血源性巨噬细胞招募到胶质瘤微环境中，其中入侵的巨噬细胞和驻留的小胶质细胞的表型和功能塑造依赖于肿瘤的基因型，例如编码IDH1型（IDH1）基因突变，与肿瘤细胞内在表观遗传和代谢改变有因果关系，也与胶质瘤患者预后良好相关。功能改变的GAM反过来通过各种机制促进肿瘤生长。GAM的一个明显的特征是抗原呈递能力和获得免疫抑制表型。在髓细胞中，小胶质细胞特异性与巨噬细胞特异性基因的连续分布，而不是双峰分布。胶质瘤微环境的时间细胞特异性功能尚未明确。德国海德堡癌症研究中心的Michael Platten等通过纵向单细胞图谱定义IDH突变型胶质瘤中的髓细胞状态，并证明其受肿瘤基因型的严格控制，文章发表在2021年7月的《Nature Cancer》杂志。
首先，作者对14个HGG中筛选出来的3万-60万小胶质细胞和巨噬细胞进行转录组测序（RNA-seq）。主成分分析显示，基于IDH的突变状态，从5例IDH野生型（WT）和5例IDH突变型HGG分离得CD45+CD3−CD19−CD20−造血细胞进行单细胞RNA-seq（scRNA-seq），并与7例脑组织对照比较，发现10个转录不同的簇，对应不同的细胞类型和状态。作者利用超几何测试发现髓细胞集群C：C0、C3、C4和C6在对照组组织富集。小胶质细胞稳态基因（TMEM119、P2RY12、CSF1R）下调，同时干扰素（IFN）信号通路和缺氧相关基因上调。小胶质细胞和巨噬细胞簇C0-C6的差异基因表达分析显示，主要组织相容性复合体（MHC）I类和II类编码基因，包括HLA-B、CD74和HLA-DPA1上调。与IDH-WT HGG相关GAM相比，后者显示稳态小胶质细胞和炎症介质编码基因，如P2RY12和IL1B的上调。接着，研究者采用飞行时间技术（CyTOF）在蛋白质水平验证scRNA-seq的发现。根据转录组分析，与IDH-WT型HGG相比，IDH-突变型HGG来源的髓系细胞小胶质细胞稳态信号的下调不明显，AP信号的上调也不明显。使用不同的CyTOF抗体组合可以检测到类似的差异。总的来说，以上数据表明，在人类HGG中，GAM的基因型依赖形成一个显著的、有差异的免疫抑制表型。为研究这种胶质瘤基因型依赖的GAM免疫抑制表型的动力学和潜在的分子机制，作者使用了GL261过度表达WT和突变体IDH HGG小鼠模型。之后作者对从IDH突变体和IDH-WT型GL261胶质瘤中分离的流式细胞纯化的CD45+细胞进行scRNA-seq，这些细胞包括小胶质细胞、单核细胞、巨噬细胞和单核细胞来源的树突状细胞（DCs）、肥大细胞、粒细胞和T、B细胞。在胶质瘤进展的两个时间点，即初发瘤后第7天和第28天进行流式分析。结果显示，在第7天，小胶质细胞由75%以上的髓细胞肿瘤组成。然而在第28天，粒细胞占主导。在第7天时，与IDH突变型胶质瘤相比，IDH-WT中侵袭性免疫细胞更为丰富，而在晚期，两种实验性HGG中造血免疫细胞含量相当。早期和晚期间有大量循环免疫细胞。作者假设，依赖于它们的IDH状态，由早期HGG微环境塑造的小胶质细胞驱动免疫细胞的分化，特别是血源性巨噬细胞。早期实验性HGG中，小胶质细胞的差异表达分析进一步表明，IDH-WT型胶质瘤编码MHC和共刺激分子的基因表达增加，而IDH突变型胶质瘤细胞显示出更高的稳态小胶质细胞基因表达。为评估稳态和激活小胶质细胞之间的逐渐变化，使用StemID2对早期小胶质细胞进行假时间分析，结果显示从稳态状态向分化状态转变。总之，IDH突变型HGG显示，早期免疫原性小胶质细胞转录谱减弱，浸润性髓细胞含量减少，而在肿瘤进展过程中含量增加。作者研究来源于单核细胞的细胞在晚期时间点的功能表型，发现在两个细胞都有AP特征的强劲表达。与IDH-WT型肿瘤相比，DCs在IDH突变型中仅表现中度特征，而IDH突变型胶质瘤的巨噬细胞显示，Il1b上调和Arg1下调。体外共培养研究时，观察实验性HGG中分离的原始T细胞、小胶质细胞和巨噬细胞发现，在细胞毒细胞和T辅助细胞中，IFN-γ的产生与程序性细胞死亡蛋白（PD）-1的上调一致且呈比例依赖性，细胞毒性T细胞中颗粒酶（Grz）B的产生减少。巨噬细胞而不是小胶质细胞在IDH突变状态下T细胞抑制水平存在差异。
为明确这种依赖于时间和肿瘤基因型的功能转变分子机制，作者将人单核细胞和巨噬细胞暴露于IDH突变体新形态酶促产物，即R-2-羟基戊二酸（R-2-HG）中。R-2-HG预处理的单核细胞或巨噬细胞与T细胞共孵育发现，T细胞增殖受到剂量依赖性抑制。在R-2-HG暴露后观察到这些蛋白的剂量依赖性下调。巨噬细胞和小胶质细胞独立于激活状态接受外源性R-2-HG。已知的转运R-2-HG的氨基酸转运体，如溶质载体（SLC）13A3过表达可导致R-2-HG的摄取增加。为验证AHR靶基因在GAM中的特异性表达，作者进行人脑胶质瘤浸润的伪时间轨迹分析，发现AHR靶基因在IDH突变型GAM中上调，而在IDH野生型GAM中不上调。根据人类数据集，在实验HGG中形成髓细胞轨迹的所有簇状细胞显示，在IDH突变体型细胞和IDH野生型细胞之间，AHR激活基因累积表达存在差异。AHR转录本在单核细胞中最为丰富，表明免疫细胞亚型特异性易受R-2-HG的重编程。AHR已确定为免疫抑制转化生长因子（TGF）-β和白介素（IL）-1β信号转导的关键辅助因子；AHR直接促进IL-10的生成。
研究显示，L色氨酸（L-Trp）的缺失减少R-2-HG对AHR的易位。累积数据表明，R-2-HG不是AHR的直接配体，为评估R-2-HG介导的巨噬细胞对T细胞的抑制依赖于L-Trp，作者分别在无L-Trp和对照培养基中与巨噬细胞进行共培养试验。剥夺暴露于R-2-HG的巨噬细胞的色氨酸，可导致共孵育T细胞的效应功能增加。基于以上发现，作者假设通过犬尿氨酸（kynurenine）途径的免疫抑制的L-Trp分解代谢驱动巨噬细胞浸润IDH突变型肿瘤的重编程。色氨酸2,3-双加氧酶（TDO2）和吲哚胺2,3-双加氧酶（IDO）1和IDO2催化犬嘌呤途径的限速步骤，共占L-Trp降解的90%。血浆中kynurenine-to-tryptophan（[l-Kyn]/[L-Trp]）的浓度比常用来表达或反映这些酶的活性。为确定L-Trp在巨噬细胞中降解的机制，作者用犬尿氨酸途径中的限速酶进行无细胞酶分析。
作者发现，在巨噬细胞中，TDO2直接被R-2-HG诱导，导致AHR配体L-Kyn的积累。因为对动物细胞来说，L-Trp的从头合成是不可能的。将人单核细胞来源的巨噬细胞暴露于R-2-HG后，会导致类似于细胞外L-Trp缺失的氨基酸转运蛋白表达模式，表明R-2-HG导致巨噬细胞中L-Trp降解增加，从而出现氨基酸饥饿样反应。与IDH-WT型肿瘤相比，在IDH突变型得差异上调，并在单核细胞到巨噬细胞的轨迹上显示一致的表达模式。结果表明，支链氨基酸（如L-Trp）的跨膜转运优先由LAT1-CD9829介导，因此可能提供R-2-HG维持犬尿氨酸通路激活所需的L-Trp。作者在体内和体外研究LAT1-CD98的抑制作用。用小分子LAT1-CD98抑制剂预处理单核细胞来源的巨噬细胞，挽救R-2-HG诱导的22个AHR靶点中的17个。同样，对胶质瘤动物模型使用LAT1-CD98抑制剂，导致IDH突变型肿瘤中MHCII+CD80+CD86+免疫刺激巨噬细胞数量增加，增强AP信号。巨噬细胞暴露于R-2-HG环境中，剥夺色氨酸导致共孵育T细胞的效应功能增强。作者的研究目的是确定人类IDH突变型胶质瘤的微环境是否具有维持L-色氨酸依赖轴得作用。利用基于基质辅助激光解吸-电离（MALDI）-MS成像（MSI）的分析方法，发现人类HGG组织中，L-Trp在细胞外聚集，如预期的那样，所有IDH突变型肿瘤均显示R-2-HG的积累，而在IDH野生型HGG或对照样品中均未检测到R-2-HG。在IDH突变型HGG细胞外有L-Trp的大量积累，显著高于IDH-WT型HGG。IDH-WT型HGG中L-Trp水平为中等，对照的样本中，L-Trp水平显著低于肿瘤样本。作者还发现IDH突变型HGG细胞内和细胞外L-Trp水平分别呈中高水平升高；巨噬细胞表现TDO2中等水平的表达，在IDH突变型肿瘤中，TDO2表达水平没有增加。总的来说，髓细胞通过LAT1-CD98对L-Trp的过度刺激以及R-2-HG依赖性摄取，维持IDH突变型HGG中GAM的免疫抑制重编程。
研究结果表明，GAM对R-2-HG诱导的T细胞的抑制依赖于L-Trp和AHR功能的积累和降解。AHR靶筛选阵列显示，小分子抑制剂抑制AHR或LAT1-CD98可有效恢复R-2-HG介导的巨噬细胞重编程。当与暴露于R-2-HG的AHR缺陷巨噬细胞共培养时，T细胞增殖或效应功能无相同的抑制。在IDH突变型肿瘤中，AHR抑制可以降低单核细胞来源的IL-10和TGF-β的生成，而在IDH-WT型肿瘤中则无此类现象发生。最后，作者指出，胶质瘤中存在一种依赖于基因型的肿瘤内网络，该网络由髓细胞组成，并确定色氨酸代谢是IDH突变型肿瘤免疫治疗的目标。
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