【中国声音】CCL14通过促进人类颈动脉斑块的新生血管而加剧斑块内的脆弱性

第一作者：李卓

通讯作者：万芪^#，栗世方

作者单位：青岛大学附属医院神经外科，^#青岛大学神经再生与康复研究院

[REF: Li Z, Qin Z, Kong X, et al. CCL14 exacerbates intraplaque vulnerability by promoting neovascularization in the human carotid plaque [published online ahead of print, 2022 Aug 13]. J Stroke Cerebrovasc Dis. 2022;31(10):106670. doi:10.1016/j.jstrokecerebrovasdis.2022.106670] PMID: 35973397

摘要

目的：通过研究CCL14对VEGF-A的调控机制，探讨CCL14在颈动脉斑块内血管生成过程和斑块易损性进展中的作用。

方法：我们首先对人类颈动脉斑块组织进行了组织学分析和免疫组织化学染色（IHC）。通过HE染色观察人颈动脉斑块纤维帽、脂质坏死核心、出血、钙化等来进行人颈动脉斑块易损性分组。通过运用油红O染色、Masson染色的方法，可以检测动脉斑块内的脂质成分、平滑肌成分；而巨噬细胞成分和胶原纤维成分则在IHC下测量CD68和α平滑肌肌动蛋白（α-SMC）的表达量进行观测；随即利用各组成分计算颈动脉斑块的易损系数。接下来我们用蛋白免疫印迹（western blot，WB）方法检查了人颈动脉斑块中的CCL14、VEGF-A、JAK2、STAT3以及JAK2和STAT3的磷酸化的蛋白表达情况。最后，我们进行可人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的体外培养，在HUVEC的成管实验中，我们使用向培养基中加入CCL14 siRNA或VEGF-A siRNA慢病毒来敲除CCL14或VEGF-A并分组，使用WB检测了上述蛋白的表达变化。

结果：人颈动脉斑块样本的组织学和Western blot分析显示，易损斑块中的CCL14和VEGF-A的表达高于稳定斑块。在HUVEC的体外培养中，发现CCL14通过激活JAK2磷酸化和通过JAK2/STAT3信号通路上调VEGF-A的表达来促进细胞间产生的管状结构的数量和长度。CCL14通过激活JAK2/STAT3信号通路来增加VEGFA的表达。

介绍

动脉粥样硬化（atherosclerosis，As）作为脑中风的首要的潜在风险，是威胁人类健康的重要因素。颈动脉粥样硬化被认为是一种以慢性局部炎症为特征的脑血管疾病，可促进缺血性卒中（Ischemic Stroke，IS）的事件发生。在炎性细胞浸润、斑块内血小板聚集、血管平滑肌细胞合成细胞外基质减少、新生血管增多等多因素共同作用下，导致了斑块的易损性进展，相较颈动脉狭窄的程度，颈动脉易损性斑块在IS 发病中的作用更为关键。尽管颈动脉狭窄患者的临床管理相对完善，但对颈动脉易损斑块的发病和发展机制知之甚少。

最近利用活体心脏磁共振（CMR）准确的在有症状的颈动脉斑块中发现了某些斑块特征，例如富含大量脂质的坏死核心和斑块内出血（IPH），同时也被认为是急性缺血性卒中的先兆。在颈动脉斑块进展的过程中，斑块内出血多被认为来自新生未成熟的血管，这些微血管血管壁很薄、容易破裂，导致血液外渗，能迅速破坏颈动脉斑块的稳定性。此外，IPH可能通过氧化应激、蛋白分解、炎症等过程引起颈动脉斑块进展。因此，探索IPH的分子机制可以更好地应对颈动脉斑块的易损性进展。

趋化因子广泛存在于人体中，多参与多种疾病进展种的细胞增殖、迁移等。各种趋化因子和趋化因子受体通过介导炎症细胞在动脉粥样硬化中发挥重要作用，尤其是CC趋化因子家族，如CCL2-CCR2通路轴可影响动脉粥样硬化中的血管炎症；CCL20可促进动脉粥样硬化中的巨噬细胞迁移，而趋化因子（C-C motif）配体14（CCL14）就是其中之一。最近的研究表明，CCL14的受体CCR5在动脉粥样硬化的进展中具有重要作用；然而，CCL14在动脉粥样硬化中的作用还没有报道。值得注意的是，我们从Gene Expression Omnibus数据库（accession number GSE125771）得知，CCL14在颈动脉易损斑块中高表达，并且可能是JAK2的上游蛋白之一。Janus kinase 2（JAK2）-signal transducer and activator of transcription 3（STAT3）-血管内皮生长因子A（VEGF-A）信号通路参与了细胞生长、分化、增殖、凋亡和炎症等多个生理过程，尤其在高血压和粥样硬化中广泛研究。因此我们计划探讨CCL14、JAK2/STAT3、VEGF-A这三者的联系，假设建立了CCL14-JAK2/STAT3-VEGF-A信号通路轴，抑制CCL14的表达，从而抑制斑块内血管新生，控制颈动脉斑块易损性进展。

材料和方法

实验人体组织

来自于青岛大学附属医院2019-2021年间接受神经外科颈动脉内膜剥脱手术的颈动脉斑块患者共30人，取其手术切除的斑块标本纳入本研究。术前对所有患者进行了双侧颈动脉超声及CT血管造影和经颅多普勒检查，并统计了这些病人的流行病学资料、临床症状、伴随疾病和治疗情况等（Table 1）。对于双侧颈内动脉狭窄率均＞50％的患者，优先对有明显的缺血的一侧进行手术，每个标本离体后，都平均分为两部分，分别10％中性福尔马林和液氮保存。根据美国心脏协会制定的颈动脉斑块易损标准，把这两部分标本又分别分为稳定斑块组（n=16）和易损斑块组（n=14）,随后对颈动脉斑块组织进行组织学、免疫组织化学染色（IHC）和免疫印迹试验（Western blot）。本研究所使用人体组织由青岛大学附属医院伦理委员会和青岛大学共同批准，并征得患者书面知情同意。所有实验均按照青岛大学的相关指导规定和《赫尔辛基宣言》进行。

Table 1. Patients’ demographics and clinicopathological data

免疫组织化学（IHC）

先将用4%多聚甲醛固定的标本进行常规石蜡包埋（脱钙、脱水）、切片（5um），接着进行伊红-苏木精（HE）染色，观察人颈动脉斑块纤维帽、脂质坏死核心、出血、钙化等。而通过运用油红O染色、Masson染色的方法，可以对动脉斑块内的脂质成分、胶原纤维成分，而巨噬细胞成分和平滑肌成分则在IHC下测量CD68和α-SMC（alpha smooth muscle Actin）的表达量进行观测。颈动脉斑块组织的微血管密度我们则通过CD31染色来进行计算。对于CCL14、JAK2\STAT3、VEGF-A等成分的阳性表达，也是通过IHC的方法来观测各成分的阳性细胞的所占的百分比，从而进行比对。

细胞培养

人脐静脉内皮细胞（HUVEC）购自ICell Bioscience Inc（Shanghai， China）。将HUVEC细胞置于含10%胎牛血清和1%抗生素（100U/mL青霉素和100g/mL链霉素）的DMEM培养基中，置于37℃、5% CO₂湿润空气的细胞培养箱中培养。细胞每两天传代一次，采用对数期细胞进行实验，第2-5代用于后续实验，以确保其稳定性。将胰蛋白酶-edta消化液（1ml，0.25%）加入到接近致密的单层细胞中，在室温下消化2~3分钟，分离细胞，得到后续实验用的细胞消化液。

CCL14和VEGF-A的调控

对于脐静脉内皮细胞（HUVECs）成管实验中的CCL14和VEGF-A的过表达，我们使用编码CCL14的重组慢病毒在HUVECs培养基中培育，使之稳定过表达。而在HUVECs中敲除CCL14和VEGF-A是通过特定siRNA完成的。

HUVEC成小管实验

为了验证CCL14对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）成管的影响，我们进行了HUVEC体外成管实验。在24孔板均匀涂抹Matrigel凝胶（10ml/孔），并在37℃孵育30min。然后把孵育好的HUVEC接种于基质细胞层，并且在培养基中分别加入CCL14、CCL14+VEGF-A siRNA、CCL14 siRNA、CCL14 siRNA+VEGF-A四组培养液（10ng/ml），同时建立空白对照组和空白慢病毒载体组（Mock）。孵育6小时后用Olympus倒置显微镜观察HUVEC的类毛细血管结构形成情况，同时拍照。最后用ImageJ软件对管长和数量进行量化和比对。

Western blot（WB）

两组收集于临床的人体斑块组织，添加RIPA细胞裂解缓冲液提取总蛋白，用bicinchoninic acid（BCA）试剂盒对比标准浓度进行蛋白浓度测定，用12% SDS-PAGE对蛋白质进行分离，使蛋白转移到PVDF膜上，随后用5％的脱脂牛奶封闭一小时，然后孵一抗摇床上一小时后-4℃过夜，第二天室温复温后用酶标二抗孵育2小时，随后采用化学发光法显影，采用Image J对图像进行灰度分析。内参蛋白为GAPDH。

统计学分析

采用Prism 8.0（GraphPad Software）软件对数据进行统计学分析，除非另有说明，所有实验都进行了三次或三次以上。计量资料均以mean±SD和P值表示。为比较两个独立组之间的统计学意义，采用2-tailed paired t tests。P＜0.05，表示差异有统计学意义。

结果

颈动脉斑块的易损指数计算

HE染色下，人颈动脉稳定斑块（Fig.1C）的纤维帽厚度为958.2um，远远大于颈动脉易损斑块（Fig.1D）的厚度44.7um。基于AHA标准，距离坏死核心最近处的纤维帽厚度＜65μm或平均厚度＜200μm将人颈动脉斑块分为两组，稳定斑块16例，易损斑块14例（Fig.1A、B）。为了测量两组斑块各自易损指数，我们选择了Masson染色、油红O染色的方式来测量斑块中的胶原纤维成分和脂质成分的染色面积。为了测量斑块中巨噬细胞和平滑肌细胞的成分占比，我们用免疫组织化学技术对两组颈动脉斑块切片进行CD68、α-SMC染色，进而测定其阳性细胞数。Masson染色下，易损斑块（Fig.1F）的纤维成分明显高于稳定斑块（Fig.1E）。油红O染色中，易损斑块（Fig.1H）中的脂质成分高于稳定斑块（Fig.1G）。IHC下测量α-SMC的表达量，易损斑块（Fig.1J）中的α-SMC含量高于稳定斑块（Fig.1I）中的。IHC下测量CD68的表达量，易损斑块（Fig.1L）中的炎性细胞高于稳定斑块（Fig.1K）。IHC下测量CD34的表达量，稳定斑块（Fig.1M）中的微血管数量远远少于易损斑块（Fig.1N）。

Fig 1. Differences in vulnerability indices of vulnerable and stable plaques in human carotid arteries. By analyzing human carotid plaque specimens, the plaques were divided into two groups: stable and vulnerable. To measure the vulnerability index of carotid plaques, we recorded HE-stained panoramic images of stable plaques (A) and vulnerable plaques (B) with magnification of X10 and BAR=1000 μm. Fibrous cap thickness of stable plaques (C) and vulnerable plaques (D). Contrasting differences between stable plaques (E) and vulnerable plaques (F) under Masson staining; differences between stable plaques (G) and vulnerable plaques (H) under oil red O staining. Differences in α-SMC,CD68,CD34 in stable plaques (I, K, M) and vulnerable plaques (J, L, N) at IHC. The positive expression of all components was higher in carotid vulnerable plaques than in stable plaques. Except for HE staining, the magnification of each image was x50 and BAR=200 μm. IHC, immunohistochemistry; α-SMC, α-Smooth muscle cells; HE, hematoxylin and eosin.

获得各组分图像后，用Image J软件计算平均光密度值的方法测算出两组颈动脉斑块中脂质、巨噬细胞、胶原纤维、平滑肌细胞的面积百分比，并根据公式：

分别计算各组标本的易感指数，并对分组情况进行验证。脆弱组和稳定组的易感系数的平均值为1.85±0.57，0.42±0.15，差异有统计学意义（t=9.423，P0.05）（表2）。

Table 2. Vulnerability index for the vulnerable and stable groups

Vulnerability index presented as mean±SD

人颈动脉斑块中CCL14、JAK2、STAT3和VEGF-A的表达增加

我们首先对两组人颈动脉动脉标本进行了切片分析，免疫组织化学染色（IHC）显示易损斑块组中的CCL14、JAK2、STAT3、VEGF-A蛋白水平较之稳定斑块组有明显增高（Fig.2A）。随后，为了验证颈动脉斑块组织中的相关蛋白表达量，我们又进行了Western blot（WB）实验分析，结果显示易损组的JAK2/STAT3，P-JAK2/P-STAT3的蛋白水平明显高于稳定组，同样的CCL14与VEGF-A的蛋白表达量也较稳定组升高（Fig.2B-C），与IHC结果大抵相同。值得注意的是，这些蛋白表达水平的差异与两组颈动脉斑块组织的狭窄程度并没有直接联系。根据以上的蛋白变化，我们猜测，CCL14可能通过JAK2/STAT3通路调控VEGF-A的表达，本阶段实验只是为了验证斑块组织中的蛋白表达差异，为之后的体外模型的构建做出了论据。

Fig 2. Differential expression of each protein in stable and vulnerable carotid plaques.Under IHC, the expression of CCL14, JAK2/STAT3, P-JAK2/P-STAT3, and VEGF-A was higher in vulnerable plaques than in stable plaques (A). These proteins were detected by Western blotting, and the expression levels were higher in the carotid vulnerable plaque group than in the stable plaque group (B), and the internal reference protein was GAPDH, followed by statistical comparison using Image J to calculate the grayscale values of each protein (C). These measures are expressed as mean ± SD, and P < 0.05 is statistically significant. Two-tailed 's t-test was used to compare the data between the two groups. * P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，S: Stable；V：Vulnerable.

CCL14促进了HUVEC的成管效应

我们首先进行了脐静脉内皮细胞（HUVEC）的成管实验，以此探讨CCL14能否促进血管内皮细胞的血管生成，并和VEGF-A产生一定的关联。HUVEC的成管实验是为了研究HUVEC在细胞外基质凝胶培养基上形成类似毛细血管样的微血管管状结构的能力。我们使用携带CCL14和CCL14 siRNA的慢病毒去感染HUVEC，在培养基（CM）孵育完成后，在光学显微镜下观测脐静脉内皮细胞的成管情况（Fig.3A），并且统计所形成小管的数量（Fig.3B）和长度（Fig.3C）。以前的研究已经证实VEGF-A对HUVEC有较强的成管实验作用，所以我们又创建了CCL14+VEGF-A siRNA培养基和CCL14 siRNA+VEGF-A培养基，同时，为了进行对照，我们加入了空白组对照（Control）和空载慢病毒组（MOCK）。结果显示，过表达CCL14组的HUVEC的成管数量和长度明显高于Control组和Mock组。相反CCL14敲除组的HUVEC相比Control组和Mock组，生成的小管数量更少，长度更短。对于VEGF-A对CCL14的影响而言，我们发现，VEGF-A siRNA可以在一定程度上抵消掉CCL14的促进HUVEC的成管实验的作用，而在CCL14 siRNA 培养基中加入VEGF-A则会抵消掉CCL14 siRNA的抑制血管成管实验的作用，我们猜测，VEGF-A可能作为CCL14的下游蛋白而存在。

Fig 3. CCL14 enhances the tube formation ability of umbilical vein endothelial cells (HUVEC) and may be associated with the expression of VEGF-A. We infected HUVEC with lentivirus carrying CCL14, CCL14 siRNA, CCL14+VEGF-A siRNA and CCL14 siRNA+VEGF-A with the addition of blank vector group (MOCK) and no treatment group (Control) (A). A standard field of view was taken for all images, and the number of tubules formed by HUVEC (B) and the length of tube formation (C) were counted. * P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，Scale bar:200 um.

CCL14通过JAK2/STAT3信号通路轴调控VEGF-A的表达

既往研究表明JAK2/STAT3通路可以通过调控VEGF-A在血管生成中发挥重要作用。为了进一步研究JAK2/STAT3在CCL14促进HUVEC血管生成过程中所扮演的角色，我们检测了JAK2和磷酸化JAK2、STAT3和磷酸化STAT3、VEGF-A的蛋白水平。我们单独提取了CCL14组和CCL14 siRNA组培养基的蛋白，通过Western blot分析各蛋白的表达。我们发现，与CCL14组相比，敲除CCL14后可以显著降低CCL14蛋白的表达水平和JAK2蛋白的磷酸化水平，进而降低STAT3蛋白的磷酸化水平，最终使VEGF-A的表达水平降低（Fig.4A、C）。接下来我们又把CCL14组分为两个实验组，分别加入VEGF-A和VEGF-A siRNA，通过Western blotting实验分析，VEGF-A siRNA处理仅仅降低了VEGF-A的表达，但并没有影响信号通路上游的CCL14、JAK2和STAT3的表达（Fig.4B、D）。值得注意的是，虽然敲除CCL14可以降低JAK2和STAT3蛋白的磷酸化水平，但我们并没有发现总蛋白水平的表达变化。这些结果表明，CCL14可以通过激活JAK2的磷酸化从而调控VEGF-A的表达。

Fig 4. CCL14 down-regulates VEGF-A protein expression through the JAK2/STAT3 signaling pathway. Total proteins were extracted by transfection of HUVEC with CCL14 and CCL14 siRNA lentivirus, respectively, and the expression of each protein was analyzed using Western blotting technique. CCL14 knockdown significantly decreased the phosphorylation of JAK2 and STAT3 proteins and the protein expression of VEGF-A (A, C). In the medium of CCL14 group, VEGF-A and VEGF-A siRNA lentivirus were transfected separately, and total protein was extracted to detect the expression of each protein, and it was found that knockdown of VEGF-A did not affect the regulation of JAK2/STAT pathway axis by CCL14 (B, D). Two-tailed 's t-test was used to compare the data of the two groups, * P<0.05, **P<0.01.

讨论

颈动脉粥样硬化是一种复杂的、长期的病理过程，是老年男性常见的血管疾病。而作为中国最高致死疾病脑血管病的关键病因，颈动脉斑块治疗显得尤为重要。在临床对颈动脉斑块的传统的可行治疗只有手术一种方式，对于手术指征也是根据影像学检查来判断颈动脉血管的狭窄度来制定的。然而，手术治疗并不适用于那些并没有临床症状的病人，并且也没有特效药去及早的治疗，所以寻找一种创新性的，有效的治疗方式显得尤为重要。

我们首先比较了Gene Expression Omnibus数据库（GSE125771），通过全基因组芯片技术筛选出在颈动脉易损斑块中显著上调的CCL14，以了解颈动脉易损斑块样本的差异性基因表达。随后，我们在KEGG通路分析中发现，CCL14作为一个上游蛋白，可以对JAK2发挥一些调节作用。以前的研究表明，JAK2-STAT3信号通路在心血管疾病（如动脉粥样硬化）中也起着重要作用。多种生理和病理过程中，VEGF-A都是关键的促进血管生成的因子之一，而VEGF-A在动脉粥样硬化疾病的产生和进展中，都扮演着促进内皮细胞再生，血管生成等重要角色，并且在多种疾病中，VEGF-A都作为JAK2/STAT3信号通路的下游调控信号发挥着作用。但令人惊讶的是，尚未有CCL14与JAK2/STAT3之间联系的详细报道。

在本研究中，我们首先用临床颈动脉斑块标本通过计算各组斑块的易损指数进行了易损性分组，并通过IHC在显微镜下直观观测了各组分含量对比，并通过Western blot技术验证了CCL14，P-JAK2、P-STAT3和VEGF在颈动脉易损斑块组中高表达，证实了CCL14在颈动脉斑块易损性进展中的作用，对我们的猜测奠定了理论基础。为了验证CCL14对JAK2/STAT3的调控作用，随后我们进行了HUVEC培养这一体外实验，通过对HUVEC的培养，观测它的细胞间的成管的长度和数量来验证CCL14对其产生的一系列作用。在之前的研究证实了，JAK2/STAT3通过VEGF-A对HUVEC的成管实验的起到明显的促进作用。我们通过慢病毒转染的方式对CCL14和VEGF-A进行过表达或者敲除，以此进行分组，我们发现CCL14可以激活JAK2的磷酸化，进而通过JAK2/STAT3信号通路轴正性调控VEGF-A的表达，而CCL14敲除后可以明显抑制VEGF-A的表达。值得注意的是，在添加CCL14后，单独敲除VEGF-A虽然会使HUVEC的成管效应被抑制，但并不影响CCL14对JAK2/STAT3的调控。与以前的研究一致，CCL14可以显著促进JAK2的磷酸化，从而通过JAK2/STAT3信号通路调控VEGF-A的表达。

结

论

斑块内出血（IPH）被认为是可能改变动脉粥样硬化生物学和自然史的重要特征，是脑血管事件的有力预测因素，许多研究表明，斑块内新生血管与IPH和斑块的易损性密切相关。如果在临床实践中正确实施IPH的早期识别和预防，预计将对缺血性卒中的一级和二级预防更加有效。我们的实验可能通过深入研究IPH的潜在机制，为IPH的病理生理学提供新的见解，并为后续IPH的发生机制提供线索。随着对颈动脉易损斑块研究的逐步深入，CCL14对新生血管这一调控机制或许会对颈动脉斑块的非手术治疗提供一种新的思路。

通讯作者简介

栗世方教授

青岛大学附属医院

医学博士，主任医师，教授，硕士研究生导师

青岛大学附属医院神经外科副主任、市南院区神经外科病区主任

山东省医学会神经外科分会委员、山东省医师协会脊髓脊柱分会副主任委员、山东省脑血管病防治委员会常务委员，青岛市医学会神经外科分会副主任委员，国家自然科学基金委员会评审专家

从事神经外科临床工作20余年，擅长颈动脉狭窄、颅内动脉瘤等脑血管病的外科治疗，迄今完成颈动脉内膜切除术近400例；对脑膜瘤、胶质瘤、垂体腺瘤等颅内肿瘤具有丰富的治疗经验

作为第一作者或通讯作者，在国际期刊和中华医学杂志、中华神经外科杂志等学术期刊发表论文40余篇；先后主持国家自然科学基金、国家863计划子课题、山东省自然科学基金及青岛市重大研究攻关课题等多项；2013年被评为青岛市优秀青年临床专家，2015、2019年度青岛市专业技术拔尖人才

万芪教授

青岛大学神经再生与康复研究院

首席教授，博士生导师，国家海外杰青

青岛大学神经再生与康复研究院院长，青岛大学医学部常务副部长

长期从事脑疾病（如：脑卒中）发生机制及治疗的研究，在脑损伤保护、干细胞再生与修复、神经递质受体功能、学习与记忆分子机制等研究方向上做出了一系列贡献。在Nature、Nature Medicine、Nature Neuroscience、Trends in Neuroscience、PNAS、Stem Cells、Stroke等期刊发表SCI论文80余篇，单篇论文引用率高达400余次

首创干细胞仪器治疗新策略，研制了一种促内源性神经干细胞脑卒中治疗仪，并形成可穿戴治疗+预警+物联网一体化产品。基于团队原创发现进行脑卒中创新药物设计，合成了全新脑卒中治疗先导化合物和脑保护小肽。申请并获得多项国家发明专利

担任国家自然科学基金会“优青”医学组二审组长、国家自然科学基金会“神经科学组”二审组长。担任“国家重点研发计划干细胞及转化研究专项”“教育部科技奖”“工信部人工智能产业创新重点任务揭榜项目”“华夏医学科技奖”终审评委专家。担任“中国医疗保健国际交流促进会”常务理事、“中国国际神经外科协会”学术委员、“中国研究型医院学会”生物治疗专业委员会委员。应邀作为多个国际期刊及基金会的评审专家

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