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帕金森病（Parkinson's disease, PD）是一种影响运动神经系统的慢性神经退化疾病。临床特征包括动作迟缓、震颤、肌强直等运动症状和非运动症状。
PD的主要病理现象是中脑黑质区（substantia nigra pars compacta, SNc）多巴胺能神经元（dopaminergic neurons, DANs）的退化，纹状体多巴胺减少和神经元内异常蛋白聚集体路易小体的形成。10%~15%的PD患者是家族遗传性的，有大量特异性的基因突变，进而引起蛋白错误折叠､异常聚集和线粒体功能异常等。
迄今为止，已有20多个基因与帕金森病或帕金森病的家族型有关，包括常染色体显性突变和隐性突变。然而，相当一部分家族性PD病例的基因仍是未知的。识别这些未知的遗传因素可能揭示调节黑质多巴胺神经元活性和PD发病机制的其他信号通路。
黑质DANs在调节运动和运动学习的活力方面至关重要，不同神经元突触前输入可动态调节黑质DANs的活性和多巴胺的释放。中脑DANs可从其胞体或树突中产生和释放内源性大麻素（Endocannabinoid (eCB)），而eCBs作为神经调节因子，包括有两种:N-花生四烯酸氨基乙醇 (anandamine, AEA)和2-花生四烯酸甘油 (2-AG)，调控多种神经元的功能。主要通过调控G蛋白偶联CB1受体逆行抑制突触前神经递质释放，调节各种生理过程，如运动学习、应激反应和记忆等。
因此了解eCB系统如何调节运动控制和学习中的多巴胺传递，可能会为PD的致病机制提供新的见解。
中南大学湘雅医院唐北沙教授团队与美国国立卫生研究院蔡怀彬教授合作于2022年6月17日在国际Top期刊《Nature Communication》（IF=14.919）发表研究性论文“Deficiency in endocannabinoid synthase DAGLB contributes to early onset Parkinsonism and murine nigral dopaminergic neuron dysfunction”，鉴定出一种新的基因-DAGLB，DAGLB基因的突变与帕金森病疾病密切相关，并揭示了帕金森病发病中DAGLB功能障碍的一种DAG特异性的病理生理机制，并为2-AG增强在缓解帕金森病中的潜在有益作用提供了理论基础和临床前证据。
唐北沙
唐北沙教授课题组主要从事神经病学尤其是神经退行性疾病与遗传病（脊髓小脑性共济失调、帕金森病、老年性痴呆、运动神经元病等）的临床和基础研究工作。建立了中国人SCA、PD、AD、ALS、FTD、CMT、HSP、癫痫等30余种神经退行性疾病和遗传病的基因诊断和分子诊断技术平台，完成了5000余例家系的基因诊断，发现了60余种世界首次报道、新的致病突变。提出多种新的理论和多种新的思维模式，为神经系统发作性疾病提供了临床研究的依据。
蔡怀彬
蔡怀彬研究员主要研究与帕金森病(PD)和ALS相关的基因突变的病理生理特性。使用体内小鼠模型和体外神经生物学方法的结合。建立了一系列新的PD和ALS小鼠遗传模型，以研究各种PD和ALS相关基因突变的病理生理表型，并测试潜在的治疗方法。另一方面利用多种组织学、电生理学、细胞生物学和生物化学方法，积极探索这些基因突变在体内和原代培养神经元中的潜在分子和细胞机制。同时利用新开发的RNA测序技术，系统地识别与黑质纹状体多巴胺能(DA)神经元变性有关的分子网络。此外，Cai团队还开发和利用新的光遗传学工具，以绘制基底神经节DA电路，选择性地影响PD。本实验的研究为这些疾病的诊断和治疗提供新的生物标志物和治疗靶点。
本文简介：
作者首先鉴定出2-AG合成酶二酰基甘油脂肪酶β (DAGLB)的功能缺失突变与早期发病的常染色体隐性帕金森病密切相关。DAGLB是黑质多巴胺能神经元(DANs)中主要的2-AG合成酶。在小鼠中，黑质的2-AG水平与运动技能学习功能显著相关。黑质DANs中Daglb基因敲除显著降低了黑质的2-AG水平，并损害了运动技能学习。但当药理抑制2-AG降解可增加黑质2-AG水平、DAN活性和多巴胺释放，改善运动技能学习功能障碍。本文证明DAGLB-缺陷有助于帕金森病的发病机制，揭示了DAGLB-介导的2-AG生物合成在黑质DANs中调节神经元活性和多巴胺释放的重要性，并提示2-AG增强在缓解帕金森病方面的潜在好处。
DAGLB突变基因
在常染色体隐性帕金森病患者的发现
唐北沙团队早在2020年发表于《Brain》中研究性论文中，通过招募一大批常染色体隐性帕金森病(ARPD)和散发早发型帕金森病(EOPD)患者，采用外显子剂量分析和全外显子组测序(WES)鉴定了多种已知PD基因的致病变异。
为了鉴定新的未知的致病基因突变，作者通过对帕金森患病4个家庭的个体全基因组单核苷酸多态性(SNP)分析发现帕金森病DAGLB的四种不同功能区域丧失突变（包括跨膜区，催化区，调节域），将4个不同的纯合子DAGLB突变（包括错义突变，移码突变）与来自4个不同中国血统的ARPD/EOPD患者联系起来。
这四种与帕金森病相关的突变都破坏了DAGLB蛋白的形成或稳定，提示DAGLB介导的信号通路的损害可能与帕金森病的发病有关（图1）。
图1
DAGLB是黑质DANs中主要的
2-AG合成酶
人类基因研究将DAGLB的缺陷与帕金森症联系起来，但Daglb缺乏如何导致帕金森病和黑质DANs功能障碍?
为了解决这一问题，作者对LCM（laser capture microdissection, LCM）分离的小鼠黑质DANs进行RNA测序，发现DAGLB是黑质DANs表达的主要2-AG合成酶，提示在帕金森病发病机制中DAGLB缺乏可能是黑质DANs特异性的机制。
为了检测DAGLB的功能，作者使用腺相关病毒(AAV)为基础的CRISPR/SaCas9基因组编辑系统，选择性敲除黑质DANs中的(KD) DAGLB或Dagla（AAV-CMV-DIO-SaCas9-U6-sgRNA），结果发现在小鼠皮层和海马神经元中DAGLB蛋白水平显著降低。
为了测量黑质区在体内的2-AG释放，作者将携带eCB2.0基因编码的eCB传感器（基于CB1受体构建的eCB2.0传感器）的AAVs注入背侧纹状体，实验结果显示当阻断黑质DANs的DAGLB表达时，背侧纹状体的AG的释放明显降低。
作者进一步采用药物JZL184（JZL184 是一种选择性的单酰甘油脂肪酶抑制剂）阻断了2-AG的降解。相比之下，黑质区 DANs中Dagla基因的缺失并不影响JZL184诱导的eCB2.0信号的信噪比增强（文章中对应图2）。综上所述，这些结果表明DAGLB是在黑质DANs中催化2-AG合成的主要2-AG合酶。
图2
DAGLB介导的2-AG
生物合成参与运动技能学习
作者团队前期的研究表明，小鼠模型中黑质DANs的基因敲除仅轻微降低小鼠行走速度，但在转棒实验中小鼠运动技能学习完全丧失，揭示了黑质DANs活动参与运动技能学习。
因此，作者通过同时进行光纤测光实时记录和旋转训练来检测信噪比中的黑质网状部（SNr）2-AG信号。实验结果表明黑质 2-AG信号在运动技能学习习得阶段特别参与运动性能的改善。
作者为了支持Daglb介导的2-AG生物合成在黑质DANs依赖的运动功能中的生理重要性，采用了AAV载体注射到DATIRESCre小鼠的黑质区，选择性地敲除黑质DANs中Daglb的表达，比较DAN-Ctrl和DAN-Daglb KD小鼠在转轮测试中黑质 2-AG水平，发现小鼠黑质DANs中Daglb的降低损害了运动技能学习早期阶段的动态2-AG释放，并损害了整体运动性能（文章中对应图3）。
图3
纹状体的多刺投射神经元CB1
受体基因缺失影响旋转运动技能学习
黑质DANs在调节运动和运动学习的活力方面至关重要。黑质DANs的活性和多巴胺的释放可被不同的突触前输入动态调节，其中背侧纹状体的直接通路纹状体刺突神经元(dSPNs)提供主要的抑制输入。
黑质DANs在调节运动和运动学习的活力方面至关重要。不同的神经元突触前输入可动态调节黑质DANs的活性和多巴胺的释放，其中背侧纹状体直接通路多刺投射神经元(dSPNs)是主要的抑制输入。
由于dSPNs也是旋转运动技能学习所必需的，并为突触后黑质DANs提供主要抑制输入的神经元。为了研究dSPNs轴突末端CB1受体是否介导运动技能学习过程中逆行2-AG信号。作者将Cnr1 fl/fl小鼠41与多巴胺受体D1-Cre (Drd1-Cre)小鼠杂交（CB1受体编码Cnr1基因），得到特异性敲除多巴胺神经元上的CB1受体，实验结果显示dSPNs中CB1受体介导的eCB信号通路的中断会影响旋转运动技能学习（文章中的图4）。但Daglb生殖细胞敲除小鼠不发生任何明显的运动行为和神经病理异常。
图4
2-AG信号增强黑质
DANs活性和胞体树突分泌多巴胺
由于黑质DANs的2-AG作用于突触前CB1受体，抑制dSPN轴突末端抑制性神经递质GABA的释放，作者推测JZL184诱导的SN中2-AG上调可能解除dSPN的突触前抑制输入，导致DAN活性增强和胞体-树突释放多巴胺。
于是作者用JZL184诱导处理，并用基因编码钙指示物gcamp6f43和多巴胺指示物DA2m 44进行纤维光度法监测DAN活性和躯干-树突多巴胺的释放。实验数据显示在黑质DANs中多巴胺和2-AG信号之间存在动态相互作用，其中DAGLB介导的2-AG生物合成在黑质DANs中促进了DAN活性和生长突多巴胺释放（文章中对应图5）。
此外，药理抑制2-AG降解增加黑质 2-AG水平，促进DAN活性和多巴胺释放，并改善小鼠转棒实验中的运动学习技能的缺陷。
图5
评论：
在这项工作中，作者鉴定出新的DAGLB的基因的突变与帕金森疾病发病机制香瓜，发现了Daglb是黑质DANs中占主导地位的2-AG合酶。进一步观察到小鼠黑质DANs中Daglb的遗传KD导致SN 2-AG水平降低和旋转运动技能学习受损。
此外，药理抑制2-AG降解促进DANs活性和多巴胺释放，并改善了运动学习技能缺陷。
但本研究依旧有些问题有待解决，一是本项研究采用CRISPR/ Sacas9介导的Daglb敲除，实现了70%-80%的敲低的效率，而其余25%的黑质DANs仍然具有完整的DAGLB活性，或许会对实验结果产生一些影响。
二是2-AG的其他来源也可能来自于黑质DANs中DAGLA的产生，以及来自SNc（黑质致密部）和SNr（黑质网状部）中非多巴胺能神经元的DAGLA和DAGLB等。总而言之，此项研究支持DAGLB-介导的2-AG生物合成参与调节黑质DANs的正常生理功能，这可能有助于解释DAGLB-缺乏如何促进PD相关的运动症状。
因此，促进2-AG的产生可能是一种潜在的机制为基础的治疗干预，以增强黑质多巴胺释放和神经元活动的患者保留足够的黑质DANs。
PMID: 35715418
DOI: 10.1038/s41467-022-31168-9
参考文献：
1. Bloem, B. R., Okun, M. S. & Klein, C. Parkinson’s disease. Lancet 397, 2284–2303 (2021).
2. Zhao, Y. et al. The role of genetics in Parkinson’s disease: a large cohort study in Chinese mainland population. Brain 143, 2220–2234 (2020).
3. Gao, Y. et al. Loss of retrograde endocannabinoid signaling and reduced adult neurogenesis in diacylglycerol lipase knock-out mice. J. Neurosci. 30, 2017–2024 (2010).
4. Tanimura, A. et al. The endocannabinoid 2-arachidonoylglycerol produced by diacylglycerol lipase alpha mediates retrograde suppression of synaptic transmission. Neuron 65, 320–327 (2010).
5. Farrell, J. S. et al. In vivo endocannabinoid dynamics at the timescale of physiological and pathological neural activity. Neuron 109, 2398–2403.e2394 (2021).
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