Cell: 最新版本3.0！宗伟建再次升级微型双光子显微镜，实现上千个神经元的钙离子活体成像

一直以来，广视野、高时空分辨率、深层组织成像技术为神经科学领域迫切需要的。早期，用于活体成像动态观察神经元结构或钙离子变化的双光子显微镜成像主要是通过麻醉后固定在操作台上，这就大大限制了其使用。

有没有可能将双光子显微镜运用到自由运动场景中，国内外科学家一直在探索。在2001年德国海德堡马克斯-普朗克神经所Winfried Denk研究团队（Winfried Denk教授是双光子显微镜的发明者，1990年在他博士后期间发明的）首次研发出微型头戴式双光子显微镜，首先就是要将双光子的激光从锁模激光器引出来，随后通过单模光纤将激光传送到微型显微镜中。

其具体参数为显微镜长7.5厘米，重25克（相当于成年小鼠的体重）。放大倍数55倍，数值孔径为0.8的镜头，可以在自由运动状态下观察血管，但是存在分辨率低、运动伪影严重等缺点，这就是最早的微型双光子显微镜的雏形。

2017年程和平院士团队重磅发布微型双光子显微镜1.0，打破了上述限制，研究成果发表在Nature Methods。第一作者为宗伟建，将庞大的双光子显微镜装置“缩小”至2.2g左右的探头，开创了自由状态下实现双光子活体观察的先河。

另一方面，利用单光子微型显微镜在自由运动状态下实现钙离子成像的技术取得飞速发展，已经广泛应用于神经科学研究中。但是，其主要的缺陷就是无法获得Z轴信息。

2021年程和平院士团队将微型双光子显微镜升级为2.0版本，成像视野扩大至420×420平方微米，成像深度为180um，但是仍然存在一些缺陷：它的重量（约5克）和光纤的刚度会干扰小鼠的运动，这不利于长时间自由运动的实验需求。

2022年3月18日宗伟建（目前在诺贝生理学奖或医学奖获得者Edvard I. Moser实验室）再次将微型双光子显微镜升级为3.0版本，能够实现大视野的钙离子活体成像，其研究成果发表在Cell杂志上。

图1:不同重量的微型显微镜对小鼠的自主运动

首先他们分别检测小鼠在未佩戴微型显微镜、佩戴5g显微镜和佩戴3g显微镜的自由运动能力，发现在佩戴3g微型显微镜几乎不影响小鼠的运动状态，5g重量明显制约其自主运动。

微型双光子显微镜第二代光纤束直径1.5mm，Z轴扫描模块采集深度为180um,重量为1.8g，加上Grins透镜、外壳、底座等材料共重约5g。而在第三代微型显微镜光纤束直径为0.7mm，Z轴扫描模块采集深度为240um,重量为0.06g，加上Grins透镜、外壳、底座等材料共重约3g，这个重量完全符合小鼠在自然状态下运动状态。

为了获得更快的成像速度和更大的成像视野，研究人员开发了两个版本的第三代，分别为微型双光子显微镜MINI2P-L（成像速度为15Hz, 成像视野为500×500平方微米）、 MINI2P-F（成像速度为40Hz, 成像视野为420×420平方微米）。

图2：第三代微型显微镜对不同区域的钙离子成像

通过对海马CA1、视觉皮层和内嗅皮层进行活体钙离子成像，可采集400-600个左右的神经元。为了采集到更多的神经元，研究人员通过增加成像视野、多个平面成像、增加邻近成像视野等方法能够实现对上千个神经元钙离子变化的同时采集。

总的来说，本文对微型双光子显微镜进行升级迭代：降低了整体重量，不影响小鼠运动能力；提高了成像速度和成像视野，获得上千个神经元的钙离子变化。

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