韩国亚洲大学医学院的Hee Hwan Park等采用人重组芳基硫酸脂酶B靶向抑制C4S糖胺聚糖，并与I-5水凝胶结合促进脊髓再生。结果发表在2022年4月的《Biomaterials》在线。
——摘自文章章节
【Ref: Park HH, et al. Biomaterials. 2022 May;284:121526. doi: 10.1016/j.biomaterials.2022.121526. Epub 2022 Apr 14.】
中枢神经系统（centralnervoussystem，CNS）急性损伤后，神经元连接中断往往导致严重的神经功能障碍。由于损伤的神经轴突不能再生，最终演变成永久性组织缺陷，如脊髓外伤后脊髓空洞形成。囊腔的形成合并蛋白性细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的缺乏严重抑制轴突的再生。研究表明，在脊髓损伤模型中注入咪唑偶联聚合（有机磷腈）水凝胶（I-5）可使富含纤维连接蛋白（fibronectin，FN）的纤维性ECM沉积，连接潜在的囊腔。然而，纤维基质的过度积累可能会阻碍轴突向水凝胶基质生长。因此，改变水凝胶相关纤维性ECM的微环境将促进轴突在基质中再生，从而提高水凝胶的性能。由一个蛋白质核心和多个硫酸软骨素糖链（chondroitin sulfate，CS）组成的硫酸软骨素蛋白多糖（chondroitin sulfate proteogcans，CSPGs）在CNS损伤后表达上调，并抑制神经轴突再生。CS糖链由4-硫酸化CS（C4S）和6-硫酸化CS（C6S）糖胺聚糖（glycosaminoglycan，GAG）链组成，其中C4S在损伤后起主导抑制作用。韩国亚洲大学医学院的Hee Hwan Park等采用人重组芳基硫酸脂酶B（arylsulfatase B，ARSB）靶向抑制C4S糖胺聚糖，并与I-5水凝胶结合促进脊髓再生。结果发表在2022年4月的《Biomaterials》在线。
研究者采用大鼠脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）模型进行体内试验。制备I-5/ARSB复合物，在体外纤维瘢痕模型中经过验证。最后，在SCI模型中注射I-5/ARSB胶水，并与聚丁二酸丁二醇酯（PBS）进行对照。采用AAV8-tdTomato追踪固有脊髓束。应用红荧光蛋白（anti-red fluorescent protein，RFP）抗体增强tdTomato的荧光信号以及Western blot分析损伤脊髓组织。采用Blyscan法测定硫酸糖胺聚糖（GAG）和硫酸软骨素的总量。将动物模型随机分为4组：单一PBS组、PBS加ARSB组、I-5水凝胶组和I-5/ARSB复合物组。使用Basso、Beattie和Bresnahan（BBB）开放式运动量表评估运动恢复状况。
大鼠脊髓损伤模型中在脊髓内形成较大的囊腔（图1），注射I-5水凝胶后纤维性ECM基本上填满囊腔。在富含FN基质边缘，可见5-羟色胺能（5-HT）轴突生长。在无I-5水凝胶注射组未发现5-HT轴突的生长。在富含FN基质中，注射CS-56后的7天内密集聚集。在第14天，CS-56免疫反应强度轻微下降，持续到注射后的28天。C4S特异性抗体染色显示C4S GAG数量增加。与C6S GAG相比，C4S具有轴突生长抑制作用。当用纯化的CSPG分子与一抗溶液孵育后，抗原结合位点的饱和几乎完全消除CS-56和C4S免疫反应。CS-56和C4S的免疫反应分布在整个基质中。
图1. 注射I-5水凝胶可防止囊腔形成，同时生成富含纤维连接素的细胞外基质，集聚CSPG。A. I-5水凝胶试验设计方案。B. 注入PBS或I-5水凝胶后4周脊髓纵向组织切片图。C. 在脊髓切面图上可见Iba-1阳性炎症细胞。D. 脊髓切片纤维连接蛋白（FN，绿色）和胶质纤维酸性蛋白（GFAP，品红）染色。在注射I-5水凝胶后，病灶中心被富含FN的ECM取代，周围由GFAP阳性星形胶质细胞包绕；而注射PBS组中出现较大的囊腔。E. 5-羟色胺抗体染色显示，血清素能轴突（5-HT，品红色）。5-HT轴突的生长被限制在距离富含FN的ECM边界几百微米的范围内。注射PBS组未见5-HT轴突生长。F. 在注射后的7、14和28天，CS-56和C4S含量变化。G. 用纯化的CSPGs预吸附验证抗体特异性。H. FN中，CS-56和C4S共存。在水凝胶制备的纤维ECM微环境分析中（图2），采用天狼星红染色显示，脊髓损伤后14天（即注射后7天）时，胶原纤维广泛而不均匀的沉积。经过21天，胶原蛋白疤痕的结构似乎更有规律，轮廓更清晰。I型和IV型胶原是脊髓损伤后胶原原纤维沉积的主要成分。经免疫组化染色显示，损伤后14和21天，胶原蛋白I型在基质中密集沉积。IV型胶原蛋白在两个时间点也在ECM中高度表达，在21天后获得巩固。当注射I-5水凝胶后，血管周围成纤维细胞标志物PDGFRβ显著增加。注射I-5水凝胶后14天，层粘连蛋白在基质中密集沉积，21天后趋于增加。结果表明，虽然I-5水凝胶可以有效防止组织缺陷，但同时也创建抑制轴突生长的ECM环境，该环境与纤维性ECM蛋白的沉积有关。
图2. I-5水凝胶介导生成的纤维ECM微环境的特征。损伤后14天和21天（即注射后7天和14天）的纵向脊髓切片图。A. 为天狼星红染色显示胶原纤维类型。B、C、D和E分别为抗1α1型胶原蛋白、IV型胶原蛋白、PDGFR β和层粘连蛋白抗体的免疫染色。在分析CSPGs是否有助于过度纤维化基质生成的研究中（图3），作者用TGF-β1（纤维化瘢痕形成的强诱导剂）分别处理包裹或不包裹CSPGs混合物的脑膜成纤维细胞。TGF-β1处理显著增加FN生成。虽然CSPG涂层本身不影响FN的产生水平，但生长在CSPG涂层组的成纤维细胞对TGF-β1的反应明显高于未生成组。在CSPGs存在的情况下，FN对TGF-β1的免疫反应几乎增加2倍。有趣的是，TGF-β1处理增加细胞间粘附，形成的大细胞簇与FN阳性细胞质间隙重叠。在CSPGs上生成成纤维细胞在TGF-β1的作用下显示比未生成CSPGs的成纤维细胞簇形成趋势更强。当ARSB与TGF-β1一起处理时，FN生成和成纤维细胞聚集程度急剧减弱。结果表明，CSPGs的沉积可以通过诱导纤维化基质的产生和成纤维细胞的聚集而形成纤维化瘢痕，但可以被CS降解酶抑制。
图3. CSPGs在纤维化瘢痕体外模型中，刺激纤维化基质的产生和细胞聚集。A. 抗纤维连接蛋白（FN）抗体染色图。B. 用TGF-β1处理后测定FN免疫反应强度。C. 成纤维细胞聚集区域的百分比；测量DAPI阳性成纤维细胞的数量。D.抗FN抗体染色图（TGF-β1联合ARSB处理）。E. 测量FN免疫反应强度。F. 测量成纤维细胞聚集区域的百分比。
鉴于以上结论，作者将水凝胶结合降解CS碳水化合物链酶时，发现可改善纤维基质中抑制轴突生长的微环境。人ARSBs与I-5水凝胶结合后，显示单一的大小峰（图4），表明几乎所有的ARSBs与I-5水凝胶都具有稳定的相互疏水作用。测量I-5水凝胶、ARSB和I-5/ARSB复合物的zeta电位显示，表面电荷比单独的ARSBs或I-5水凝胶具有更大的负性，表明位于这些分子内部的亲水离子肽通过相互疏水作用向外迁移。相比之下，I-5/软骨素酶ABC复合物的表面zeta电位与单独的软骨素酶ABC或I-5水凝胶的zeta电位相当，说明复合物形成不存在荷电亲水肽向外移位的现象。上述结果显示，I-5水凝胶可以通过两个分子之间的强大疏水作用与ARSBs组合。因此，作者决定使用I-5水凝胶复合物ARSBs来降解CSPGs。
图4. I-5/ARSB复合物的生成和表征。A. 使用Zetasizer测量I-5水凝胶、I-5/ARSB复合物和I-5/软骨素酶ABC（ChABC）复合物的分子大小。B、C. I-5水凝胶、ARSB和I-5/ARSB结合物以及ChABC和I-5/ChABC结合物Zeta电位的测量。D. I-5水凝胶与ARSB基于疏水相互作用的组合示意图。E. 展示I-5/ARSB复合物的体外释放动力学。F. 在体外释放ARSB的硫酸酯酶活性。G. 显示37℃下的溶胶凝胶转变行为。H. 展示I-5水凝胶和I-5/ARSB复合物的体外降解动力学；两种水凝胶的降解动力学无明显差异。在脊髓损伤后1周，作者将I-5水凝胶/CSPG降解酶复合物注入损伤中心。基于CS-56免疫反应性测定，与单独注射I-5水凝胶相比，I-5/ARSB复合物降低CS糖链的总数量（图5）。注射I-5/ARSB复合物的动物对C4S的免疫反应也显著降低。而软骨素-6-硫酸酯酶（C6Sase）复合物与I-5水凝胶复合物注入病灶后，并没有显著地降低CS-56或C4S的免疫反应水平。在CSPGs定量评估中，与未损伤的脊髓组织相比，接受I-5水凝胶的脊髓损伤组织含有相当高水平的硫酸GAGs。注射I-5/ARSB复合物可显著减少脊髓组织溶解物中硫酸化GAG数量，表明I-5/ARSB复合物可减少CSPGs的沉积。评估动物运动功能恢复时，在损伤后6周注射I-5/ARSB复合物组显示比其他3组的运动质量好。在该组中，部分大鼠恢复前后肢协调的节律性运动。重复测量双因素方差分析显示，不同治疗组的效果具有统计学意义（F=4.145，p＜0.05）。治疗因素与伤后不同时间节点的交互作用也具有显著性差异（F=3.432，p＜0.001）。4组之间多重比较检验显示，仅对照组（PBS注射不含水凝胶）与I-5/ARSB组之间有统计学差异（p＜0.05）。在特定时间点对两组进行多项比较时，发现与对照组相比，I-5/ARSB复合物组在伤后6周及6周以后的运动能力有显著改善。伤后7周，单纯注射I-5水凝胶组BBB评分也显著高于对照组，说明注射水凝胶本身对促进运动功能恢复有效果。伤后9周，I-5/ARSB组与单一I-5水凝胶组之间的运动恢复差异显著。网格行走测试中，与注射PBS对照组相比，仅使用ARSBs或I-5水凝胶注射组的后肢放置错误次数趋于减少。仅I-5/ARSB复合物注射组后肢放置在网格跑道上的准确性显著提高，而且误差明显小于其他3组。可见在I-5水凝胶中加入ECM修饰酶ARSB可以增强水凝胶对脊髓损伤后运动功能的改善作用。
图5. 注射I-5/ARSB复合物可减少CSPG的沉积并改善运动恢复。A. 注射I-5水凝胶、I-5/ARSB复合物和I-5/C6Sase（软骨素-6-硫酸酯酶）复合物的脊髓切片分别采用纤维连接蛋白（FN）和软骨素-4-硫酸酯（C4S）以及CSPG（CS-56）的染色图以表示。B、C. 测定CS-56和C4S免疫反应强度的定量分析。D. 使用糖胺聚糖（GAG）测定脊髓裂解液中的CSPG含量。E. 采用BBB量表评估运动恢复。F. 网格行走试验示意图。G. 后肢错位的数量除以网格上的后肢总步数的百分比表示误差。在I-5/ARSB复合物是否可以在体内调节ECM纤维化的研究中，作者用Western blot定量分析水凝胶注射后4周FN水平（图6）。应用培养的脑膜成纤维细胞验证FN免疫反应的特异性。未受损伤的大鼠脊髓组织中FN免疫反应强度很低。将I-5水凝胶注入损伤脊髓后，FN的免疫反应性显著增加，这与水凝胶产生的ECM中FN的免疫反应性有关。在注射I-5/ARSB复合物后，FN免疫反应活性显著降低。作者进一步评估I-5/ARSB复合物在不同时间点对水凝胶制备的ECM纤维微环境的影响。与Western blot结果显示的FN水平下降一致，I-5/ARSB水凝胶注射组FN免疫反应强度比I-5单独注射组显著降低50%以上。天狼星红染色展示在含有I-5/ARSB复合物的动物内总胶原量显著减少。当进行胶原纤维的单个成分分析时，作者发现IV型胶原，而不是I型胶原，被I-5/ARSB复合物显著减弱。对血管周围成纤维细胞标记物PDGFR-β的免疫反应性也显著减弱。此外，层粘连蛋白的数量减少50%以上。这些结果表明，ARSB作为I-5水凝胶的复合物能够充分缓解纤维微环境，可使水凝胶生成的ECM更有利于轴突的再生。损伤后炎症反应强烈影响脊髓纤维化瘢痕的形成，而I-5水凝胶单独调节损伤后巨噬细胞趋于活化。因此，作者认为I-5/ARSB可能通过调节损伤后炎症反应间接调节ECM纤维微环境。
图6. I-5/ARSB复合物缓解水凝胶诱导的ECM中的纤维微环境。A. 展示抗纤连蛋白抗体免疫印迹图；以培养的脑膜成纤维细胞（Fib）为阳性对照，在注射后4周，将I-5水凝胶和I-5/ARSB复合物注射到原始脊髓和损伤脊髓中，获得组织裂解物；采用GAPDH进行加载控制。B. 免疫印迹分析定量图。C-H. 注射I-5水凝胶后13周脊髓切片分别采用抗纤维连接蛋白（FN）、I型胶原、IV型胶原、PDGFR-β和层粘连蛋白抗体对组织切片进行免疫染色图，以显示脊髓病变中纤维化蛋白的积累。D. 用天狼星红染色显示总胶原原纤维的数量。
脊髓损伤后5周，5-HT轴突已经生长到水凝胶形成的ECM中，但生长被限制在距离ECM边界几百微米的范围内。注入I-5/ARSB复合物可显著增加水凝胶基质中5-HT轴突的再生数量。更重要的是，5-HT轴突仅在I-5/ARSB复合物组中生长。量化单个再生轴突的平均长度发现，I-5水凝胶组与I-5/ARSB复合物组之间没有显著差异。注射后9周（伤后10周）进行组织学评估分析（图7），发现tdTomato阳性轴突穿过FN阳性基质的吻侧边界。I-5水凝胶组中，轴突进入基质几百微米后，生长似乎突然受到限制。I-5/ARSB组轴突在基质深处的生长也倾向减少，但减少的程度明显小于I-5水凝胶组。I-5/ARSB复合物组，单个再生轴突往往更长，导致轴突平均长度和轴突数量增加，这些轴突跨越矩形感兴趣区中的虚构垂直线。轴突在尾部基质边界以外的脊髓中生长，有时只在I-5/ARSB复合体组中观察到。在腰椎髓内的单一水凝胶组中，tdTomato阳性的固有脊髓轴突非常少，而且大多数轴突长度小于100μm。相比之下，I-5/ARSB复合体组的固有脊髓轴突数量显著增加，其中许多轴突被拉长，长度超过100μm，轴突总长度增加。固有脊髓轴突经常表现出类似突触前钮扣样肿胀外观，表明与腰椎脊髓神经元突触接触的形成。最后，I-5/ARSB复合物咪唑部分与巨噬细胞相互作用，形成纤维性ECM桥接囊腔。ARSB通过降解CSPG修饰纤维性ECM的微环境从而促进脊髓再生。
图7. I-5/ARSB复合物可促进脊髓固有轴突在水凝胶形成ECM内外的再生。A. 损伤后13周脊髓纵向切面图。从FN染色（绿色）观察I-5水凝胶生成的ECM，用AAV8-tdTomato标记固有脊髓轴突（品红色）。黄色虚线表示水凝胶生成的ECM和宿主脊髓之间的边界。白色箭头表示轴突再生超出水凝胶生成的ECM边界极限。边框区域表示矩形感兴趣的位置。A1、A2的白色垂直虚线位于距矩形感兴趣区中心250μm处。B. 展示基质内固有棘突轴突密度。C. 显示感兴趣区内再生轴突长度和横过垂直线的轴突数量。D. 为量化图。E. 损伤13周后腰脊髓横截面图。脊髓固有轴突用AAV8-tdTomato标记（品红）。白色箭头显示脊髓固有轴突肿胀，提示突触前钮扣。F、G. 比较腰椎脊髓固有轴突数量和总轴突长度的定量图。H.脊髓横断面（L2-L3水平）灰质共聚焦显微图，用抗MAP2（绿色）（树突标记物）和synaptotagmin（灰色）（突触前标记物）进行抗体染色。
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