目的：免疫抑制是胶质瘤及其它许多癌症的标志性特征之一。雷公藤甲素是一种从中药雷公藤中纯化提取的一种天然化合物，据报道雷公藤甲素可抑制PD-L1（也称为B7同源物1（B7-H1））在乳腺癌中的表达。本文旨在研究雷公藤甲素对胶质瘤引起T细胞抑制的影响。
方法：将T细胞标记，并与干扰素-γ（IFN-γ）和雷公藤甲素处理过的胶质瘤细胞共培养。然后通过流式细胞检测雷公藤甲素对与胶质瘤引起T细胞及其亚型的抑制作用的影响。同时又检测了PD-L1在六种胶质瘤细胞系中的表达。
结果：发现雷公藤甲素能逆转胶质瘤对于T细胞尤其是CD4+T细胞的抑制，并诱导IFN-γ分泌。此外，雷公藤甲素还可以促进白细胞介素-2的分泌，抑制白细胞介素-10的分泌。同时雷公藤甲素还可以下调IFN-γ诱导的胶质瘤细胞PD-L1表面表达。
结论：雷公藤甲素可逆转胶质瘤细胞对CD4+T细胞的抑制，下调PD-L1的表达，可能可以作为检查点抑制剂之一PD-L1的替代候选药物。
胶质母细胞瘤是最常见的侵润性的脑肿瘤，在目前的治疗下平均生存时间只有14.6个月。其中治疗失败的一个原因是在胶质瘤本身对于机体免疫的抑制。机体免疫抑制是胶质瘤和其他许多癌症的标志性特征之一。最近，有报道称，程序性细胞死亡蛋白1配体（PD-L1）也被称为B7-H1，可以抑制T细胞和诱导T细胞凋亡从而引起这种免疫抑制。另外，有报道提示特异性单克隆抗体阻断PD-L1可以逆转这种抑制，显著提高治疗效果，同时还可以改善树突状细胞介导的抗肿瘤免疫 。最近又有报道称，抗PD-L1单克隆抗体对许多癌症的治疗是安全和有效的。然而，制备单克隆抗体的成本昂贵。另外T细胞具有逃避抗体调节PD-L1功能的机制。所以目前急需需要找到一种替代候选方案来下调PD-L1的表达并逆转T细胞抑制。
雷公藤甲素（TPL）是一种传统的中草药，具有抗炎的功效。TPL还可抑制乳腺癌细胞中PD-L1的表达。然而，TPL对胶质瘤患者末梢血中T细胞抑制的作用尚不清楚。本研究的目的是来明确TPL是否能够逆转T细胞抑制和下调胶质瘤细胞PD-L1的表达。为此，我们使用免疫学方法测试了TPL对T细胞增殖和PD-L1表达的影响。
在这项研究中，我们发现了雷公藤甲素可以逆转由胶质瘤细胞引起的T细胞抑制（图4a），并下调IFN-γ诱导的PD-L1表达（图3a）。有趣的是，我们发现，与CD8+T细胞（图5cd，图6cd）相比，用雷公藤甲素处理后，CD4+T细胞受抑制的程度明显（图5ab，图6ab），另外逆转更为显著。在胶质瘤细胞与正常PBMC共培养上清液中， 我们进一步证实了有IFN-γ 和IL-2的分泌（图4c）以及IL-2（图6a）。同时发现IL-10分泌受到抑制（图6b）。
有报道提示雷公藤甲素可抑制乳腺癌中PD-L1的表达12。另外雷公藤甲素还可抑制胶质瘤细胞的增殖和侵润14，同时可以增强替莫唑胺胶质瘤诱导的细胞凋亡，并增强胶质瘤干细胞中NF-kappaB信号的抑制15。然而，雷公藤甲素对胶质瘤细胞T细胞抑制作用的研究尚未见报道。我们的结果发现，雷公藤甲素可以逆转胶质瘤引起的T细胞抑制（（41.7%（TPL处理）至32.7%（TPL未处理））（p<0.01）。我们进一步研究到底是哪个T细胞亚群被明显的逆转。对CD4+和CD8+T细胞分别进行分析。我们发现CD4+T细胞是主要的被逆转细胞。我们的发现与Flies研究小组的报道一致，他们发现CD4+T细胞是癌症患者免疫抑制的主要原因。胶质瘤患者的免疫抑制是由很多因素引起的，如调节性T细胞、髓源性抑制细胞（MDSCs）、胶质瘤细胞源性分泌性免疫抑制因子（TGF-β2、IL-10、PGE2）、人类白细胞抗原-G（HLA-G）、吲哚胺2,3-双加氧酶（IDO）和具有PD-L1等免疫抑制作用的胶质瘤细胞膜结合因子。有报道提示PD-L1与胶质瘤的免疫抑制有明显相关性。由于免疫抑制是胶质瘤生长和复发的主要的一个原因。前一段时间，在小鼠模型中，我们又报道了PD-L1与胶质瘤浸润有关。我们用IFN-γ处理胶质瘤细胞，以便诱导MHC II和PD-L1的表达。然后用雷公藤甲素进一步处理胶质瘤细胞。我们发现雷公藤甲素可以下调所有胶质瘤细胞系中PD-L1的表达（图3abc）。我们的结果与其他报道一致，进一步说明雷公藤甲素可已成为靶向T细胞负性调节因子PD-L1的备选化合物。
由于有效的免疫应答需要CD4+T细胞具有分泌IFNγ的能力，以增强抗原的交叉呈递。我们进一步检测了IFNγ的分泌量（图4c），T细胞与雷公藤甲素处理或雷公藤甲素不处理的胶质瘤细胞进行共培养18小时后的结果。我们发现，雷公藤甲素处理后胶质瘤细胞的T细胞中的 IFNγ分泌量较高（p<0.01）。
我们又进一步检测了共培养48小时后免疫刺激细胞因子IL-2和免疫抑制细胞因子IL-10的分泌情况。结果（图7ab）进一步证实了我们的假设，即可IL-2分泌增加和IL-10分泌减少。
我们这项研究的局限性主要是T细胞增殖率不高。这可能是由于在共培养条件下缺乏共刺激的作用。在这项研究中，我们使用抗CD3抗体来激活T细胞，而不使用CD28的共同刺激。这可能就是为什么活化T细胞的增殖相对较低，而CD4+T细胞增殖的逆转率不是很高的原因。
总之，我们发现雷公藤甲素可以逆转胶质瘤细胞对CD4+T细胞的抑制，可以作为下调PD-L1表达的替代候选药物。该药物可作为胶质母细胞瘤治疗的一种替代方法，值得进行下一步的动物研究。
图1. IFN-γ诱导胶质瘤细胞系PD-L1表达。
图2. 雷公藤甲素（TPL）的化学结构和浓度。
图3. 雷公藤甲素下调IFN-γ诱导的PD-L1表达。
图4. 雷公藤甲素逆转胶质瘤细胞对T细胞的抑制，诱导IFN-γ分泌。
图5. 雷公藤甲素逆转胶质瘤细胞对CD4+T细胞（T98G）的抑制作用。
图6. 雷公藤甲素逆转胶质瘤细胞对CD4+T细胞（U251）的抑制作用
图7.IL-2和IL-10的分泌。
Zhang L, Yu JS. Triptolide reverses helper T cell inhibition and down-regulates IFN-γ induced PD-L1 expression in glioma cell lines. J Neurooncol. 2019 Jul;143(3):429-436.
张 雷
中国医科大学附属盛京医院
神经外科教授
日本山梨大学神经外科，博士。
加拿大卡尔加里大学，美国梅奥诊所神经外科博士后。美国西奈山医学中心神经外科，科学家。
