脑血管病以其高病死率､高致残率成为威胁人类生存的重要疾病,但至今对其仍无公认､有效的神经保护剂｡近年来,研究者们对神经保护药物在缺血性卒中临床转化失败的结果中分析了很多可能原因,其中一种观点是过去治疗缺血性脑血管病时过于注重对神经元的保护,而忽略了对白质的保护^[1-2]｡ 随着现代神经影像学技术的发展,临床上发现,中枢神经系统的很多疾病都存在白质损伤,从新生儿的脑室周围白质软化､成年期的卒中到老年人的血管性痴呆, 白质均是缺血､ 缺氧损伤的靶点^[3-5]｡ 虽然脑缺血可促使机体诱导少突胶质细胞前体细胞(oligodendrocyte precursor cells, OPCs)新生,但大部分OPCs 不能发育成为成熟的少突胶质细胞, 致髓鞘化不充足, 影响脑缺血后的白质修复^[6-7]｡

在过去的30 年里,基础研究结果显示,促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)在治疗缺血性脑血管病中展现出良好的神经保护效果^[8-9]｡德国的一项多中心临床试验研究(Ⅱ/ Ⅲ期临床试验,Clinical-Trials. gov,注册号:NCT00604630)结果表明,由于重组组织型纤溶酶原激活剂(rt-PA)联合EPO 治疗急性脑缺血患者可使患者出现严重并发症,包括死亡､出血､血栓栓塞事件,因此,EPO 不适用于采用rt-PA溶栓治疗的脑缺血患者^[10]｡然而,该临床试验的进一步分析结果表明,对于未rt-PA 溶栓的脑缺血患者,EPO 能产生有效的神经保护效果,改善患者的神经功能评分｡这个结论与该中心第1 次的EPO 治疗脑缺血的临床试验结论相一致^[11]｡以上结果表明,EPO 可能成为临床治疗缺血性卒中的潜在神经保护剂｡除了不能与rt-PA 联用,另一个影响EPO临床转化的问题是其促红细胞生成作用｡在急性脑缺血早期,EPO 需高剂量和多次全身给药,才能穿过血-脑屏障进入脑组织,达到有效的治疗浓度,这会导致严重的副作用,如血栓形成和继发性梗死^[12]｡值得注意的是,EPO 的促红细胞生成作用与其组织保护作用可能是通过与不同受体分别独立介导的^[13]｡基于以上研究,我们将EPO 的促红细胞生成的基因序列中位于104 位的丝氨酸突变到异亮氨酸,制作成变构EPO(mutant EPO,MEPO),使EPO 完全丧失了促红细胞生成活性,但仍对脑缺血小鼠具有神经保护作用^[14-15]｡我们最近的研究结果显示,MEPO 可改善成年雄性小鼠脑缺血后神经功能,促进其白质修复^[16]｡本研究拟在此基础上,进一步验证MEPO 对脑缺血雌性中年小鼠脑组织中胶质细胞及白质的影响,评价其保护作用,为其向临床转化研究提供更多的基础研究数据｡

中年(10 月龄)雌性C57BL/6J 小鼠30 只,体质量(25 ±2)g,购自斯贝福(北京)生物技术有限公司[动物许可证号:SCXK(京)2019-0010]｡实验所使用的动物均经过首都医科大学宣武医院实验动物委员会批准(动物伦理号:XWH20210128),遵守动物福利和伦理的相关规定｡恒温条件下饲养,实验前一晚禁食但不禁水｡将30 只小鼠按随机数字表法完全随机分为3 组,每组10 只:(1 )假手术组(Sham 组):分离血管,不结扎或凝断血管;(2)模型组(Vehicle 组):脑缺血+与MEPO 相同用量的等渗盐水;(3)MEPO 组:脑缺血+ MEPO｡造模术后即刻按照5 000 IU/ kg 体质量的剂量腹腔注射MEPO 或等渗盐水,每隔1 d 给药1 次,直到术后14 d｡术后第2 天开始,按照50 mg/ kg 体质量的剂量腹腔注射5-溴-2′-脱氧尿苷(5-Bromodeoxyuridinc,  BrdU),每日1 次,直至术后11 d｡记录每只动物每天的体质量｡将每组动物分为第1､第2 两组,每组5 只,记录每组动物死亡数量｡第1 组在术后3 d 处死,取脑组织进行2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride, TTC)染色;第2 组在术后14 d取脑组织,制作冰冻切片,进行免疫荧光染色｡

MEPO 为美国匹斯堡大学曹国栋教授赠送｡实验所用单抗购于北京谊诚盛盈生物科技有限公司:髓鞘碱性蛋白抗体(anti-myelin basic protein,anti-MBP,兔来源)､神经丝200 抗体(anti-neurofilament200,anti-NF200,小鼠来源)､CD16 抗体(anti-CD16,大鼠来源)､CD206 抗体(anti-CD206,山羊来源)､Iba1 抗体(anti-Iba1,兔来源)､Iba1 抗体(anti-Iba1,小鼠来源)､2′,3′-环腺苷酸-3′-磷酸二酯酶(2′,3′-cyclic nucleotide 3′-phosphodiesterase, CNPase, 兔来源)､BrdU(小鼠来源)､CCAAT 增强子结合蛋白β抗体(anti-CCAAT enhancer binding protein β,anti-C/EPBβ,小鼠来源)｡所有二抗购自美国Jackson ImmunoResearch 公司,封片剂为4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI;0100-20,Southern Biotech,美国)｡双极电凝(德威ACC100,北京天业爱博科贸有限公司)､正置免疫荧光显微镜(Eclipase 80i,日本尼康公司)､超声波细胞粉碎机(SCIENTZ-IID,宁波新芝生物科技有限公司)､冰冻切片机(CM1900,德国莱卡公司)､脱色摇床(TS1,江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司)｡

采用大脑中动脉远端血管永久性闭塞的方式制备小鼠脑缺血模型^[5]将C57BL/6J 小鼠用70%一氧化二氮和30%氧气混合气体及4%恩氟烷气体混合诱导麻醉,使用70%一氧化二氮和30%氧气混合气体及1. 5%恩氟烷气体混合维持麻醉｡仰卧位固定于手术台上,备皮后颈部正中开约1 cm 的切口,钝性分离肌肉､筋膜后暴露右侧颈总动脉,进行结扎后缝合颈部切口｡随后将小鼠左侧卧位固定于手术台上,于右侧外眦和耳道连线处进行备皮并开1 个约0. 5 cm 的切口,分离并切断颞肌后暴露颅骨,用小鼠颅骨钻在颅骨上开1 个直径约2 mm 的孔,暴露右侧大脑中动脉主干及侧支血管后电凝后剪断｡显微镜下观察动脉侧支血管无血液流出证明建模成功,缝合皮肤后用碘伏消毒,眼部涂药膏保护眼球｡在手术过程中,通过温控垫将小鼠肛温维持在(37.0 ±0.5)°C｡

小鼠脑缺血3 d 后,腹腔注射水合氯醛(300 mg/kg)麻醉,用0. 1 mol/ L 磷酸盐缓冲液配制的0. 04 g/L 多聚甲醛磷酸盐溶液经右心室快速灌注,断头取脑后进行连续冠状切片(2 mm 厚度),用磷酸盐缓冲液配制的0. 02 g/ L TTC 染色,染色后红色区域为正常脑组织,白色区域为脑梗死组织｡用数码相机拍摄,使用Image J 图像分析软件计算脑梗死及水肿面积｡脑梗死百分比= (正常侧大脑半球面积- 患侧大脑半球非梗死区面积)/正常侧大脑半球面积×100% ｡脑水肿百分比= (正常侧大脑半球面积-患侧大脑半球的面积)/正常侧大脑半球面积×100% ｡

将冰冻切片平衡室温后,用磷酸盐缓冲液洗3 次,每次5 min,随后用0. 1 mol/ L 磷酸盐缓冲液配制的0. 03 g/ L 驴血清封闭2 h;按照1∶ 100 的比例加一抗,4 ℃孵育过夜;加入相应驴来源的荧光标记二抗,室温孵育30 min;用DAPI 标记细胞核及封片,荧光显微镜下观察并记录｡荧光强度的比值以及双阳性细胞的计数采用Image J 分析软件进行检测｡

应用免疫荧光染色检测MBP 和NF200,用MBP/ NF200 荧光强度比值评价髓鞘脱失程度,也表示白质损伤程度,两者比值越小,脑白质损伤越严重｡采用Iba1 标记小胶质细胞,CD16 标记M1 型小胶质细胞,CD206 标记M2 型小胶质细胞,采用免疫荧光染色检测小鼠脑缺血后14 d 脑组织中小胶质细胞表型变化｡用CNPase 标记成熟少突胶质细胞,BrdU 标记新生细胞,两者共染阳性(CNPase + /BrdU + )表示新生的少突胶质细胞｡此外,用Iba1标记小胶质细胞,转录因子C/ EBPβ 用绿色荧光标记,C/ EBPβ + / Iba1 +双阳性细胞指表达C/ EBPβ 的小胶质细胞｡

利用GraphPad Prism 7 统计学软件进行统计学分析｡实验所得数据采用Shapiro-Wilk 正态性检验进行正态分析,正态分布的计量资料以x- ± s 表示｡两组之间各指标脑梗死百分比和脑水肿百分比､CD16 + / Iba1 + ､CD206 + / Iba1 + 细胞数量指标采用Student′ s t 检验;多组之间的各指标比较,如MBP/ NF200､CNPase + / BrdU + ､C/ EBPβ + / Iba1 + 细胞数量等的比较采用单因素方差分析及采用Tukey事后比较法进行事后分析;不同时间点的各处理组之间小鼠体质量､贴纸接触时间和移除时间等的比较采用重复测量双因素方差分析及Tukey 事后比较法进行事后分析｡以P≤0. 05 为差异有统计学意义｡

术后3 组小鼠存活状况显示,Vehicle 组小鼠死亡2 只(分别于术后12 d 和13 d),MEPO 组小鼠死亡1 只(术后3 d),Sham 组小鼠无死亡｡用于术后3 d 的TTC 染色分析小鼠脑梗死百分比的数量为每组5 只,由于染色过程中Vehicle 组和MEPO组小鼠分别有2 只的缺血侧脑组织发生部分丢失,因此分析小鼠脑水肿百分比的数量为每组3 只｡术后14 d,各组小鼠存活数量分别为Sham 组5 只,Vehicle 组3 只,MEPO 组4 只｡因此,用于体质量､行为学分析的小鼠每组统一为3 只｡最终存活的所有小鼠用于后续免疫荧光分析,分别为Sham 组5 只,Vehicle 组3 只,MEPO 组4 只｡

重复测量双因素方差分析结果显示,时间效应F(14,84)= 5. 066,P < 0. 01;组别效应F(2,6)=3.623,P =0. 090;交叉效应F(28,84)= 2. 110,P =0. 005｡与Sham 组比较,Vehicle 组小鼠体质量在术后第1､2､6､7 天明显降低,差异均有统计学意义(均P < 0. 05);与Vehicle 组比较,MEPO 组小鼠体质量虽然有增加趋势,但差异均无统计学意义(均P >0.05)｡见表1,图1｡

2. 2. 1 接触时间:重复测量双因素方差分析结果显示,时间效应F(6,36)= 5. 003,P < 0. 01;组别效应F(2,6)=5. 634,P = 0. 042;交互相应F(12,36)=1. 964,P =0. 059｡3 组小鼠接触时间在各观察时间点差异均无统计学意义(均P > 0. 05)｡见表2,图2a｡

2. 2. 2 移除时间:重复测量双因素方差分析结果显示,时间效应F(6,36)= 5. 320,P < 0. 01;组别效应F(2,6)= 10. 570,P = 0. 011 (图2b);交互效应F(12,36 )= 3. 212,P = 0. 003｡与Sham 组比较,Vehicle 组小鼠在脑缺血后第1､5､14 天移除时间均明显增加(均P < 0. 05);而与Vehicle 组比较,MEPO组小鼠在脑缺血后第1､5､14 天的移除时间则明显降低(均P <0. 05)｡见表2,图2b｡

脑缺血后第14 天,免疫荧光染色结果显示,与Sham 组小鼠脑组织相比,Vehicle 组和MEPO 组小鼠脑组织均出现脱髓鞘现象,而MEPO 组脱髓鞘明显轻于Vehicle组(图4a)｡脑缺血后第14 天,Sham 组､Vehicle 组､MEPO 组3 组小鼠的MBP/ NF200 荧光强度比值分别为4. 6 ± 0. 8､0. 9 ± 0. 5､2. 9 ± 1. 0,差异有统计学意义(F =18. 750,P <0. 01);与Sham 组比较,Vehicle 组和MEPO 组小鼠脑组织皮质区MBP/NF200 荧光强度比值显著降低(P < 0. 05 );与Vehicle 组比较,MEPO 组小鼠脑组织皮质区MBP /NF200 荧光强度比值显著升高(P <0. 05,图4b)｡

免疫荧光染色结果显示,Sham 组的小胶质细胞处于静息状态,未发生活化,故不做小胶质细胞活化表型的数量统计;相比Sham 组,Vehicle 组和MEPO 组的M1和M2型小胶质细胞均发生活化｡与Vehicle 组比较,MEPO组中CD16+ / Iba1+小胶质细胞数量呈现降低的趋势,但差异无统计学意义(P > 0. 05);而MEPO 组中CD206 + / Iba1 + 小胶质细胞数量较Vehicle组明显增多(P < 0. 05),小胶质细胞更倾向于M2 表型极化｡见图5,表4｡

小鼠脑缺血后第14 天后,免疫荧光染色结果显示,Sham 组小鼠脑组织中出现少量新生的少突胶质细胞｡相比Sham 组,Vehicle 组和MEPO 小鼠脑组织中新生的少突胶质细胞数量均有一定程度增加(图6a,6b)｡Sham 组､Vehicle 组､MEPO 组CNPase + / BrdU +的细胞数量分别为(1. 6 ± 0. 9)､(15. 7 ± 4. 9)､(26. 3 ± 5. 1)个/ mm2,3 组间差异有统计学意义(F = 48. 000,P < 0. 01);与Sham 组比较,Vehicle 组和MCAO 组脑缺血同侧组织中CNPase + / BrdU+细胞数量均显著增加(均P <0. 05);与Vehicle 组比较,MEPO 组中CNPase + / BrdU +细胞数量明显增加(P <0. 05)｡见图6c｡

小鼠脑缺血后第14 天后,免疫荧光染色结果显示,Sham 组小鼠脑组织中出现少量表达C/ EBPβ 的小胶质细胞｡相比Sham 组,Vehicle 组和MEPO 组小鼠脑组织中小胶质细胞发生明显活化,胞体变大｡此外,Vehicle 组和MEPO 组小鼠脑组织中C/ EBPβ阳性的细胞数量也明显增加(图7a)｡Sham 组､Vehicle 组､MEPO 组C/ EBPβ + / Iba1 + 细胞数量分别为(1. 4 ± 1. 1)､(33. 3 ± 11. 6)､(18. 3 ± 6. 7)个/mm2,3 组间差异有统计学意义(F = 21. 750,P <0.01)｡与Sham 组比较,Vehicle 组和MEPO 组脑缺血同侧组织中C/ EBPβ + / Iba1 + 细胞数量均显著增加(均P < 0. 05);与Vehicle 组比较,MEPO 组中C/EBPβ+ / Iba1+细胞数量明显减少(P <0.05)｡见图7b｡

神经保护药在缺血性卒中临床转化失败的一个重要原因可能是过去研究者过于关注神经元胞体(灰质)的保护,而忽略了对白质的保护^[17]｡白质主要由轴突纤维､少突胶质细胞和其他胶质细胞组成,少突胶质细胞产生髓鞘,包裹在轴突外,促进神经脉冲的跳跃式传导以及保护轴突｡脑白质对缺血损伤十分敏感,白质损伤几乎占据梗死体积的50% ,包括髓鞘损伤､白质胶质化等,可导致很严重的神经功能缺损^[3,6]｡因此,脱髓鞘是缺血性或出血性脑损伤的一个重要的病理现象,对髓鞘的保护也是脑血管病及多种神经变性病的治疗靶点^[18-19]｡缺血性卒中发生脱髓鞘,常导致进行性不可逆神经行为功能障碍,特别是老年卒中患者^[20]｡研究结果表明,小胶质细胞M2 表型可促进少突胶质细胞新生,进而加快轴突再髓鞘化和白质修复^[21]｡既往研究结果显示,MEPO 可以促进中年雄性小鼠脑缺血后小胶质细胞向M2 表型转化,并最终修复白质^[22]｡本研究进一步验证MEPO 保护白质的作用是否也对中年雌性脑缺血小鼠有作用｡此外,本研究中采用了小鼠大脑中动脉远端血管永久性闭塞模型,充分保证了脑组织梗死位置和梗死范围的均一性｡结果表明,MEPO 组雌性小鼠在脑缺血急性期的脑梗死百分比及脑水肿百分比较Vehicle 组均有明显降低｡与之对应的神经功能在术后较短的时间内得到恢复,证实了MEPO 对中年雌性脑缺血小鼠的神经保护作用｡有研究显示,在新生儿胼胝体和皮质区的缺氧缺血性损伤14 d 后,延迟进行EPO 治疗显著增加了MBP/ NF200 荧光染色的比值^[22]｡本研究结果与之相似,MEPO显著提高中年雌性小鼠缺血性脑损伤后第14 天皮质的MBP/ NF200 比值,提示MEPO 可以抑制脑缺血后髓鞘的脱失｡

小胶质细胞在脑损伤后的神经炎性反应中发挥重要作用,其与巨噬细胞有相似的特征,按照不同的作用,可分为M1 和M2 表型｡研究表明,在损伤部位存在M1 和M2 激活的混合小胶质细胞,M1 小胶质细胞可增加炎性反应前介质的分泌,抑制轴突再生,而M2小胶质细胞可促进神经新生^[23]｡因此,探寻可以调节小胶质细胞表型的分子开关,并通过干预将脑缺血后小胶质细胞向M2 表型转变,是治疗脑血管病的一个可行的策略^[23-24]｡这种观点虽也有争议,认为将小胶质细胞分为M1 表型和M2 表型过于简单^[25],但最近几年的研究证实了其可行性｡在脑出血模型中,将小胶质细胞表型向M2 转变,可以促进少突胶质细胞分化,调节白质修复^[26]｡既往研究结果均已证明,EPO和MEPO可以调节小鼠脑缺血后小胶质细胞的表型向M2 转化,发挥保护作用^[16,27]｡在本研究中,MEPO 的这种作用同样体现在中年雌性脑缺血小鼠上｡

C/ EBP 是碱性亮氨酸拉链类的转录因子,已经在C/ EBP 家族中发现了6 个成员(α､β､γ､δ､ε､ζ)｡C/ EBPβ 和C/ EBPδ 参与神经元突触可塑性,同时调节胶质细胞促进炎性反应^[28]｡在阿尔茨海默病的发病机制中,C/ EBPβ 的激活刺激载脂蛋白E4 的表达,从而促进阿尔茨海默病的病理进程^[29]｡而这一进程很可能与小胶质细胞中C/ EBPβ 激活后刺激小胶质细胞分泌促炎因子相关,而抑制C/ EBPβ 激活可有效阻断这一进程[30]｡我们的结果显示,MEPO组的小胶质细胞中C/ EBPβ 明显减少,这可能是促使小胶质细胞向M2 表型转化的关键机制｡

综上所述,本研究结果提示,MEPO 减少中年雌性小鼠脑缺血后3 d 的脑梗死和脑水肿程度,并改善脑缺血后的神经功能｡在脑缺血后第14 天,MEPO通过降低小胶质细胞中C/ EBPβ 的表达,调节小胶质细胞向M2 表型转化,促进少突胶质细胞新生,从而达到修复脑白质的作用｡