缺血性卒中(ischemic stroke,IS)是由于脑的供血动脉狭窄或闭塞,脑供血不足,导致脑组织坏死的总称^[1-2],是造成人口残疾和死亡的主要疾病原因之一^[3]｡尽管IS 的复发率近年来有所下降,但其发病率､患病率及伤残调整寿命年却均上升或呈现上升趋势^[4]｡1999 年,Nicholson 等^[5]提出代谢组学的概念:生物系统对生理和病理刺激以及基因改变的代谢应答的定量测定｡其与基因组学､转录组学和蛋白质组学共同构成系统生物学,因其最接近疾病的进程而得到了广泛的发展｡代谢组学不仅具有易处理性,而且循环代谢产物处于基因组学､转录组学､蛋白质组学和环境变化的下游^[6-7],这使IS 的发生发展能更全面､动态地被评估｡机体循环代谢水平改变贯穿于IS 的病理生理变化的全过程^[8]｡在临床诊疗过程中,机体某些代谢产物水平变化在IS 的病因､危险因素､诊断､预后和复发等方面具有显著的意义,可能作为潜在生物标志物,并指导IS 发生发展的相关研究｡

急性缺血性卒中(acute IS,AIS)发生后脑局部和全身代谢发生改变,导致机体循环代谢产物水平变化和(或)新的代谢产物生成,造成细胞兴奋性毒性､氧化应激､线粒体功能损伤､血-脑屏障功能障碍､炎性反应等病理生理反应,最后导致细胞死亡和脑损伤^[6,8]｡代谢产物分子量小^[6-7],能轻松穿过血-脑屏障^[9]｡利用质谱和核磁共振^[7]检测技术,对血液､脑脊液､尿液等生物样本进行代谢组分析,能捕捉机体在IS 发生过程中的循环代谢产物水平变化和特征,很大程度上可以反映IS 的整体特征^[10-11]｡

在不同的氨基酸中,酸性氨基酸——谷氨酸在大脑中具有兴奋神经递质的作用,而在血液和脑脊液中,谷氨酸的浓度低于碱性氨基酸——赖氨酸和精氨酸的浓度^[1]｡脑缺血发作时或发作后,由于能量消耗,导致膜电位丧失和神经细胞去极化^[1],造成突触前神经细胞释放大量谷氨酸,并通过过度激活N-甲基-D-天门冬氨酸和α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸受体,从而增加细胞内钙离子浓度,并激活分解代谢过程,最终导致细胞死亡^[2,12-13]｡烟酰胺是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的前体[14],可以作为聚二磷酸核糖聚合酶抑制剂,帮助预防在局部缺血事件中由于一氧化氮水平升高引起聚二磷酸核糖聚合酶活化不当,造成的DNA 损伤和细胞死亡^[15]｡在IS期间,由于聚二磷酸核糖聚合酶的激活不当,造成细胞摄入烟酰胺过多,同时,由于谷氨酸受体被过度激活,造成三磷酸腺苷被过度利用,最终导致细胞死亡^[16]｡因此,谷氨酸和烟酰胺是促成血栓形成和局部缺血的重要因素｡

赖氨酸和精氨酸被证明与脑损伤保护有关｡在实验大鼠模型中,静脉内给予赖氨酸和精氨酸,可抑制谷氨酸诱导的神经细胞活性,从而降低其对脑缺血损伤的作用^[17]｡同时,赖氨酸分解代谢是人脑中合成谷氨酸的重要底物,烟酰胺在赖氨酸的分解代谢途径中起着重要的底物作用^[18]｡因此,在脑缺血过程中,机体消耗烟酰胺,随后在赖氨酸再分解代谢过程中,赖氨酸转化为谷氨酸,再转化为其他与应激相关的代谢物,最终降低赖氨酸循环水平^[1]｡

IS 的病理生理变化过程还涉及其他的氨基酸代谢相关途径｡例如,高水平血浆同型半胱氨酸可促进氧化应激,从而通过对血管平滑肌的促有丝分裂作用､对血管内皮的细胞毒性和血栓形成作用,导致细胞损伤和(或)死亡^[19]｡尤其高半胱氨酸的酸性衍生物,即L-同型半胱氨酸亚磺酸已被证明是大鼠脑细胞代谢型谷氨酸受体的选择性激动剂,这解释了脑缺血期间同型半胱氨酸介导的损伤的发病机理^[20]｡同时,低水平的赖氨酸及其代谢产物和高水平的同型半胱氨酸亚磺酸通过协同作用,可能引发卒中风险患者机体内部的兴奋性毒性^[1]｡

使用代谢组学技术研究发现,脂质代谢产物与IS 之间也存在相关性^[21-22]｡脂肪酸氧化作为机体次要的供能途径,能为大脑提供约20%的能量^[23]｡在AIS 发生后,机体通过负反馈调节启动能量产生反应,例如脂肪酸降解应对体内能量缺乏,从而维持稳态^[24]｡氧化应激是IS 的主要病理生理反应之一,而脂质代谢的变化与氧化应激引起的线粒体功能障碍有关^[25],但它们之间具体的关系暂不明确｡亚油酸是长链脂肪酸,可以穿过血-脑屏障为大脑提供能量^[26],L-棕榈酰肉碱也参与脂肪酸降解^[27]｡在IS 急性期,亚油酸和L-棕榈酰肉碱的循环水平增加可能与脂肪酸分解代谢增加,维持机体内能量平衡有关^[27]｡花生四烯酸是磷脂膜的主要成分,通过甘油磷脂降解的代谢途径被释放出来｡花生四烯酸在整个生命过程中都参与各种生物膜的流动､信号转导和基因转录^[28]｡在IS 的病理生理过程中,游离花生四烯酸通过花生四烯酸级联反应增加自由基的产生^[29],并在缺血再灌注后,其代谢显著增加^[27],这是IS 后组织氧化损伤的主要因素｡

一碳代谢途径和叶酸代谢途径中的代谢产物半胱氨酸､同型半胱氨酸亚磺酸､甜菜碱和氧化型谷胱甘肽在IS 发生发展过程中表现为循环水平增加^[1,10,21],而丝氨酸､叶酸､5 -腺苷同型半胱氨酸､甲硫氨酸表现则相反^[10,21]｡叶酸､四氢叶酸､半胱氨酸､S-腺苷同型半胱氨酸和氧化型谷胱甘肽参与“叶酸循环”和联合激活“一碳循环”,并在稳定蛋白质和DNA,合成其他分子,对抗活性氧代谢物的毒性中发挥重要作用,但其循环水平的改变与IS 之间的具体机制尚不明确^[30]｡与能量代谢有关的代谢产物——乳酸､丙酮酸水平升高^[31-32],尿液中柠檬酸盐水平降低均与IS 有关^[31]｡这些变化与IS 后血液中的氧含量下降,血清葡萄糖的无氧糖酵解有关｡一些其他代谢产物,如鞘氨醇和肾上腺素乙醇胺涉及甘油磷脂代谢和鞘脂代谢途径,是IS 潜在的生物标志物;同时,尿酸作为嘌呤代谢的产物,可刺激氧化应激､血管内皮功能障碍､炎性反应和血管收缩,并可能通过促进脂质过氧化､低密度脂蛋白氧化､氧自由基和血小板黏附增加,促进早期血栓形成^[33]｡

血脂异常和糖尿病是IS 与代谢有关的危险因素^[4]｡与传统危险因素相比,直接量化代谢产物水平可能是一种更准确的评估方法｡在Marklund 等^[34]的研究中,汇总了30 项前瞻性观察研究的数据,发现IS 发生风险与亚油酸(主要为饮食中的ω-6 多不饱和脂肪酸)循环水平呈负相关(HR = 0. 88,95% CI:0. 79 ～ 0. 98,P < 0. 05 )｡而且,该变化在含有rs174547 的T 等位基因携带者中更明显^[35]｡有研究结果表明,卒中发生风险的增加与某些代谢产物水平下调有关,例如,高精氨酸水平减低引起血管内皮功能障碍^[36],2-酮戊二酸､烟酰胺､缬氨酸与泛醌的水平减低加剧氧化应激反应^[1],最终导致卒中发生风险增加｡一项来自以IS 为唯一终点事件的社区动脉粥样硬化风险研究的个体代谢谱结果显示,IS 的发生风险与2 种长链二元羧酸[十四烷二酸酯(OR =1.76,95% CI:1. 21 ～2. 56,P =0. 003);十六烷二酸酯(OR = 1. 60,95% CI:1. 11 ～ 2. 32,P =0.012)]循环水平呈正相关,同时,这2 种长链二元羧酸循环水平与心源性栓塞型卒中(cardioembolicstroke,CES)发生风险相关^[37]｡这2 种长链二元羧酸代谢物都是脂肪酸ω-氧化的产物,但其与CES之间的因果关系尚不明确｡Stegemann 等[38]的前瞻性队列研究结果表明,循环中高水平的三酰甘油和胆固醇是包括卒中在内的复合心脑血管事件终点的预测因素(HR = 1.22,95% CI:1.03 ～ 1. 44,P =0.0201;HR = 1. 24,95% CI:1. 04 ～ 1. 47,P =0.0142)｡这与侧重于胆固醇和总脂质水平管理的做法不同,凸显了根据脂质具体成分进行脂质管理的必要性｡

可直接量化的机体代谢产物作为IS 危险因素的潜在生物标志物,可能在早期通过调整饮食结构､改变环境及使用药物等方式干预而使患者获益｡但是,这些干预方式也会成为运用代谢组学探究机体代谢产物与IS 危险因素之间关系的干扰因素｡因此需要针对患者IS 前状态,更深入认识代谢产物可能参与的有关代谢途径,进一步标准化干预方式,以获得更加可靠的研究结果｡

代谢产物种类繁多且半衰期不同,一旦代谢物循环水平变化,将比其他生物分子更早地预示急性发作的疾病｡Sheth 等^[39]对神经酰胺(42 ∶ 1 亚型)和鞘磷脂(36∶ 0 亚型)两种特定的脂质分析发现,这两种脂质可以区分IS 患者与模拟卒中患者(受试者工作特征曲线曲线下面积为0. 8712)｡但是,该研究仅纳入了14 例患者,限制了最终结论的可靠性｡Hu 等^[40]研究通过质谱方法分析了IS 或脑出血患者的血样(干血点样品)通过检测发现,天冬氨酸和替格左旋肉毒碱的循环水平,以及精氨酸/鸟氨酸､缬氨酸/苯基丙氨酸和(游离肉碱+乙酰肉碱+丙酰基肉碱+棕榈酰基肉碱+玫瑰果肉碱)/瓜氨酸3 个代谢物比值,共5 个变量,正确识别了79%的卒中患者｡该研究纳入超过200 例患者,研究结果在内部进行了验证,但未针对人群和血管危险因素调整代谢物水平,同时未进行外部验证,因此难以被推广｡Kimberly 等^[41]研究对卒中后患者血浆中68 种代谢物的质谱分析结果表明,IS 患者的支链氨基酸(缬氨酸､亮氨酸和异亮氨酸)水平降低,同时,其降低程度可能与IS 严重程度相关(P =0. 04)｡但由于选择了针对性代谢组学方法且样本量小(短暂性脑缺血发作患者32 例,卒中患者52 例),使统计分析十分谨慎,因此很难评估此结果在更大的样本中的可靠性｡这项研究选择关键的前哨代谢物,包括氨基酸､核苷酸和特定的神经递质,这些代谢物对一些重要的生化途径至关重要,值得期待在更大的队列,包括所有卒中亚型中,验证支链氨基酸是否能够作为IS的临床生物标志物或治疗靶标｡Lee 等^[1]的研究表明,缬氨酸在IS中的代谢水平变化与Kimberly 等^[41]的结果一致,并且高危卒中患者的血清赖氨酸及其分解代谢产物水平变化与卒中发生相关(均P < 0.05)｡一项基于质谱方法探究AIS 患者血清的代谢特征的研究表明,一组5 种不同的代谢产物,包括丝氨酸､异亮氨酸､甜菜碱､磷脂酰胆碱(5∶ 0 /5∶ 0 亚型)和溶血性磷脂酰乙醇胺(18 ∶ 2 亚型)具有区分AIS 组与健康对照组的潜力^[10]｡但是,代谢产物是作用于IS病因机制途径还是其他途径仍需要更进一步的基础研究｡

IS 病因亚型主要通过临床监测及头部影像学的方式判定^[42]｡能否利用代谢产物能否区分IS 病因亚型,能够为临床诊断带来更加快速､准确的方法｡一项通过调整各种混杂因素(如基线美国国立卫生研究院卒中量表评分和血管危险因素)的研究表明,CES 患者的血浆游离脂肪酸水平高于其他IS 病因亚型患者[43],潜在的原因可能是游离脂肪酸具有血栓形成作用｡Nelson 等^[44]通过质谱定量分析AIS患者血浆样品中144 种循环代谢产物,评估其区分CES 和非CES 的能力,发现CES 患者的三羧酸循环中间产物——琥珀酸､α-酮戊二酸和苹果酸水平高于非CES 患者｡由于琥珀酸还与左心房扩大和亚临床心房功能不全相关(OR = 1. 54,95%CI:1. 23 ～1.94,P <0. 01)^[44],提示CES 及心脏结构异常患者的能量代谢发生改变｡该研究首次将能量代谢产物与CES 和心脏结构异常联系在一起,从而支持了_CES 的异常心房基质模型^[45]｡另有研究表明,CES可能的生物标志物是B 型钠尿肽,在该卒中亚型中其循环水平升高^[46-47]｡Santamarina 等^[48]以CES 患者和明显的主动脉弓动脉粥样硬化的AIS 患者作为栓塞型卒中组,与原因不明型卒中组比较,结果表明,高水平的B 型钠尿肽与栓塞型IS 有关(OR =8.06,95% CI:2. 34 ～27. 72,P <0.01)｡

三羧酸循环中的中间代谢产物可能具有区分CES 的潜力,可为CES 的可能病理机制提供新的角度｡但对非CES 的探究尚缺乏,即其他几种IS 病因亚型之间的代谢产物是否存在区别,代谢途径是否不同,是否可以作为潜在生物标志物目前尚不明确｡目前仍有约25%的出院患者无IS 的具体病因学诊断^[49]｡因此需要进一步研究并认识IS 各病因亚型的代谢组学特征,探究不同病因亚型IS 的病理机制｡

在Chi 等[50]的研究中,细胞内和细胞外的血小板活化因子(platelet activating factor,PAF)均为与IS预后相关的化合物,PAF 参与促炎介质释放､花生四烯酸代谢､嗜酸性粒细胞脱粒和活性氧产生｡但在该研究中,功能预后不良的IS 患者PAF 水平低于预后良好的IS 患者｡这与既往研究结果,即发生AIS后PAF 与血小板的结合增加,与轻型卒中相比,重型卒中患者的PAF 结合更为突出^[51]存在矛盾｡造成这样结果的原因可能是在AIS 患者中,PAF 水平增加,PAF 与血小板的结合速度增加^[52],因此PAF的产生､分解和消耗被加快可能导致AIS 患者的PAF 血清水平不稳定｡AIS 发生后,PAF 的消耗可能比产生更快,从而导致其循环水平低于病前阶段｡因此,是否将PAF 变化水平作为AIS 的生物标志物,需要更多地研究AIS 不同阶段的PAF 水平动态变化｡针对PAF 在AIS 中神经保护的调节途径也值得进行临床试验｡有研究表明,PAF 受体拮抗剂2,4,6-三甲基-1,4-二氢吡啶-3,5-二羧酸(LAU-0901)可减少梗死体积,改善实验性卒中的神经功能预后^[53]｡另外,5 种代谢物组合如丝氨酸､异亮氨酸和磷脂酰胆碱(5∶ 0 /5∶ 0 亚型)血清水平的下调以及甜菜碱和溶血性磷脂酰乙醇胺(18 ∶ 2 亚型)血清水平的上调可能与AIS 良好预后相关^[10],而支链氨基酸水平降低的程度则可能与更差的神经功能预后(改良Rankin 量表评分3 ～ 6 分)相关(P =0.002)^[41]｡也有研究结果表明,血浆中神经酰胺水平与AIS 的预后相关^[54]｡

AIS 临床预后的相关研究表明,氨基酸相关代谢途径与其具有较高的相关性,但二者间是否存在因果关系尚需要开展更多的病例随访及其生物标本监测的纵向研究,了解可能的潜在生物标志物的动态变化水平,进而指导IS 的早期治疗｡

发现能够预测IS 复发的早期生物标志物,可以有效减少IS 反复发生和不良临床预后｡IS 或短暂性脑缺血发作后第1 周是卒中复发的高风险期^[55]｡肽素､脂蛋白相关的磷脂酶A(2)､溶血磷脂酰胆碱等与短暂性脑缺血发作复发或卒中复发可能相关,但其效能均存在争议^[56-58]｡Seo 等^[59]通过研究用于区分AIS 患者CES 并预测卒中复发的新型生物标志物发现,中链酰基肉碱(癸酰基肉碱和辛酰基肉碱)与CES 呈正相关(癸酰基肉碱:OR = 2. 839,95% CI:1. 241 ～6. 493,P = 0. 013;辛酰基肉碱:OR = 3. 562,95% CI:1. 369 ～9. 268,P =0. 009),与卒中复发显著相关(癸酰基肉碱:HR =3. 767,95% CI:1. 276 ～11. 117,P =0. 016;辛酰基肉碱:HR = 5. 519,95% CI:1. 622 ～18. 781,P = 0. 006),这些关联独立且一致｡但是,该研究为单中心研究,选择人种单一且以非靶向代谢组学为研究方法,因此结论较难推广｡此外,相关代谢谱与CES 间关联的病理生理机制尚不明确｡因此进一步验证中链酰基肉碱作为CES 和卒中复发的新型生物标志物的价值,将酰基肉碱与CES 之间的联系应用于临床治疗方面是必要的｡

代谢组学在多组学的研究中以下游代谢产物为目标,具有其他以上游生物信息研究为目标的传统组学不具备的优点｡但任何一种单一的组学均无法完全认识及了解IS｡考虑到IS 的复杂性及异质性,基于代谢组学研究IS 的意义,不应局限于发现潜在生物标志物与IS 的临床相关性,更重要的是进一步探究IS 病理生理变化､致病机制等｡同时,需要在长期随访IS 患者并监测其生物样本的代谢产物的动态变化中,纵向获得更多的代谢组学特征｡结合其他组学研究,了解IS 机体代谢水平随时间的动态变化可能有助于确定生物标志物检测的最佳时间点､特定药物的治疗时间窗等,从而进一步改善IS的临床诊疗效果｡