文章来源：中国脑血管病杂志, 2021, 18(5):303-310.
作者：万强 李庭庭 肖媛 张昕 孙丽英 张玉荣 李文志 杨万超
通信作者:杨万超,Email:dachao_1980@126.com
摘要:
目的 研究吸入高浓度氢气对大鼠脑缺血-再灌注损伤的影响及其机制｡
方法 纳入雄性健康无特定病原体(SPF)级Sprague Dawley(SD)大鼠72 只,采用随机数字表法进行完全随机化分组,将实验动物随机分为3 组,分别为假手术组(S 组)､脑缺血-再灌注组(M 组)和氢气治疗组(H 组),每组24 只｡S 组结扎并离断左侧颈外动脉,M 组与H 组建立大鼠大脑中动脉栓塞(MCAO)模型,S组､M组大鼠于再灌注前1 h､再灌注后20 h和44 h 3个时间点吸入45 min 空气(21%O2-78%N2),H组于再灌注前1 h､再灌注后20 h和44 h 3 个时间点吸入45 min 高浓度氢气(42% H2-21% O2-37% N2)｡于再灌注后48 h 断头处死大鼠,观察大鼠脑梗死面积及脑组织水肿情况,采用Western blot 法检测细胞焦亡相关蛋白含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1(Caspase-1)及凋亡相关斑点样蛋白(ASC)含量,采用酶联免疫吸附测定(ELISA)方法检测白细胞介素1β(IL-1β)和IL-18 水平,并记录大鼠缺血-再灌注后1､3､5､7 d 时神经功能评分[改良神经功能缺损评分(mNSS)､Garcia 评分]､体质量变化情况以及生存状况｡
结果 缺血-再灌注后48 h,3 组大鼠脑梗死面积及脑含水量比较,差异均有统计学意义(F 值分别为289. 70､95. 90,均P < 0. 01);与M 组比较,H 组脑梗死面积及脑含水量均明显减少[分别为(30. 5 ± 3. 0)%比(38. 0 ± 1.9)% ,(79. 1 ± 0. 2)%比(83. 3 ± 0. 6)% ;均P <0.05]｡3 组大鼠缺血-再灌注后48 h 脑组织Caspase-1､ASC 表达水平均差异有统计学意义(F 值分别为107.10､100. 70,均P <0. 01)｡与S 组比较,M 组脑组织Caspase-1､ASC 表达水平均显著增加(均P <0. 05);与M 组比较,H 组脑组织Caspase-1､ASC 水平均明显降低(均P <0. 05)｡3 组大鼠缺血-再灌注后48 h 后血清中IL-1β 和IL-18 表达水平差异均有统计学意义(F 值分别为65. 58､59. 36,均P <0. 01)｡与S组比较,M组IL-1β和IL-18 水平均显著上升[分别为(74. 2 ±1. 6)ng/ L比(58. 3 ±0.6)ng/ L,(176. 7 ±11. 3)ng/ L比(102. 9 ±4. 5)ng/ L;均P <0. 05];与M 组比较,H 组IL-1β 和IL-18水平均明显降低[分别为(60. 9 ±2. 7)､(125. 5 ±8. 4)ng/ L;均P <0. 05]｡与S 组比较,M 组大鼠缺血-再灌注后1､3､5､7 d 时,mNSS 明显升高,Garcia 评分明显减低;与M 组比较,H 组大鼠缺血-再灌注后1､3､5､7 d 时,mNSS 明显减少,Garcia 评分明显升高,差异均有统计学意义(均P < 0. 05)｡3 组大鼠缺血-再灌注后1､3､5､7 d,S 组大鼠体质量无降低且逐渐增加,H､M 组大鼠体质量均先减低再恢复,H 组大鼠再灌注后体质量减低幅度小于M 组,且早于M 组恢复至初始水平｡大鼠死亡集中于再灌注后24 h 内,共有8 只大鼠死亡,M 组死亡6 只,H 组死亡2 只,S 组大鼠无死亡｡Log-rank 分析两组大鼠生存率结果显示,H 组大鼠生存率高于M 组大鼠(P =0. 0272)｡
结论 吸入高浓度氢气可显著改善大鼠脑缺血-再灌注损伤的神经功能及预后,其机制可能与氢气减轻神经细胞焦亡及炎性因子浸润相关｡
卒中是我国致死､致残率最高的疾病[1],缺血性卒中再灌注后的严重神经功能障碍是影响患者生存质量的主要因素[2]｡炎性反应是缺血性卒中发展的重要病理因素,炎性因子浸润导致的神经细胞损伤及脑水肿与神经系统不良预后密切相关[3]｡细胞焦亡是由含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1(cysteinylaspartate specific proteinase-1,Caspase-1)相关蛋白酶介导的促炎性细胞死亡的程序化过程[4],其在多种炎性相关疾病中起着至关重要的作用[5-6],在调节炎性反应机制上的作用已成为众多研究者关注的焦点｡氢气是一种无色､无味的医学气体,在脑损伤研究中证实,氢气能够减轻脑部炎性反应､抑制氧化应激和细胞凋亡,改善神经功能,发挥神经保护作用[7-8]｡目前,已有较多的研究证实了氢气对脑损伤发挥保护作用,但有关氢气对脑缺血-再灌注损伤的作用的研究相对较少｡因此,氢气对脑缺血-再灌注损伤的作用仍需进一步探索｡为此,本实验通过建立大鼠大脑中动脉栓塞模型,研究高浓度氢气吸入对脑缺血-再灌注损伤大鼠是否发挥保护作用及其可能的作用机制｡
1 材料与方法
1.1 试剂与仪器
兔抗大鼠β-actin(1∶ 400;ZSGB biotechnology,中国),兔抗大鼠Caspase-1 (1 ∶ 2 000;Origin#TA323204S,美国),兔抗大鼠凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containinga CARD,ASC;1∶ 2 000;Origin #TA326289S,美国);酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbentassay,ELISA)试剂盒[Boster,#白细胞介素1β(IL-1β),#IL-18,中国];AMS H-01 氢氧气雾化机(赪美医疗科技,上海);大脑中动脉栓塞(middlecerebral artery occlusion,MCAO )线栓(Doccol,#403556Pk,美国);2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride,TTC)染色剂(Biofroxx,#2273GR005,美国)｡
2 动物与分组
实验经哈尔滨医科大学附属第二医院医学伦理委员会动物实验伦理审批(审批号:SYDW2020-016)｡实验动物选择雄性健康无特定病原体(specificpathogen free,SPF)级Sprague Dawley (SD)大鼠72 只,体质量200 ～ 250 g[由哈尔滨医科大学实验动物学部提供,许可证号:SCXK(黑)2013-001],禁食不禁饮｡应用随机数字表进行完全随机化分组,将实验动物随机分为3 组,分别为:假手术组(S 组)､缺血-再灌注组(M 组)和氢气治疗组(H 组),每组24 只｡54 只大鼠于再灌注48 h 后处死,其中18 只(每组6 只)用于观察脑组织缺血情况,18 只(每组6 只)用于检测脑含水量,18 只(每组6 只)用于Western blot､ELISA检测;另外18 只大鼠(每组6 只),于再灌注后1､3､5､7 d 时,依次记录大鼠神经功能评分､体质量变化情况｡大鼠死亡后,从总体(80 只)剩余大鼠中补充,以维持每组24 只｡
1.3 气体制备
AMS H-01 氢氧气雾化机,电解蒸馏水,按照1∶ 2制备氧气､氢气混合气体,氮气进行充盈｡大鼠在配备的专用金属防爆箱中吸入氢气,防爆箱内配有气体回路及尾气吸收装置,实验过程中应用氢气浓度检测仪进行气体浓度测定｡S 组､M 组大鼠于再灌注前1 h 及再灌注后20 h､44 h 3 个时间点吸入45 min 空气(21% O2 -78% N2 ),H 组大鼠于再灌注前1 h及再灌注后20 h､44 h 3 个时间点吸入45 min氢气｡为保证组间吸入气体氧浓度一致,氢气浓度为42% H2 -21% O2 -37% N2,相较于既往研究用的3%氢气浓度[9],此氢气浓度为高浓度｡
1.4 模型制备
建立大脑中动脉栓塞模型[10],3 组实验大鼠经面罩给予5%七氟烷进行麻醉诱导,2% ～ 3% 七氟烷用于麻醉维持,保留自主呼吸｡术区备皮消毒,1%利多卡因局部浸润麻醉后在颅顶两耳连线中点做一约0. 5 cm 正中切口,寻找前囟,以前囟为零点,在前囟左侧4 mm､尾侧1. 5 mm 处固定脑血流探头,应用激光多普勒脑血流检测仪进行脑血流监测｡缓慢翻身,颈部备皮消毒,1%利多卡因局部浸润麻醉后行正中切口,显微镊钝性分离皮下组织,暴露左侧胸锁乳突肌,逐步游离二腹肌､胸锁乳突肌及肩胛-舌骨肌,肌间可见到左侧颈动脉鞘｡钝性分离颈总动脉､颈外动脉及颈内动脉｡电凝离断颈外动脉与颈内动脉之间的交通支及颈外动脉侧支,结扎并离断左侧颈外动脉,S 组操作截止至此步骤,M 组与H 组后续使用动脉夹夹闭颈总动脉近心端及颈内动脉远心端,从颈外动脉残端置入线栓,脑血流突然下降,下降幅度大于基础值70%以上,固定线栓,缝合切口｡记录线栓插入时间及脑血流值｡栓塞90 min后取出线栓｡术后送至小动物麻醉后监测治疗室苏醒,并进行保温｡待大鼠清醒后进行Longa 评分,2 分即为建模成功[10]｡H 组大鼠建模成功后吸入氢气｡
1.5 脑组织缺血区观察
大鼠再灌注48 h 后,在七氟烷深麻醉下迅速断头取脑,将脑组织置于冰板上放入- 20 ℃ 冰箱,20 min 后取出脑组织,进行切片｡第3 片大脑切片为缺血核心区域,其余脑切片按照每片约2 mm厚度,分别向嗅球及小脑部冠状面切片,共6 片脑切片｡将切片置于现配的1% TTC 试剂中,避光,置于37 ℃温箱中15 min 后取出脑切片,1%多聚甲醛固定10 min,按照从嗅球部到小脑部顺序平铺于黑色背景板上｡染色后脑梗死区域呈现白色,非梗死区域呈现红色｡用Image J 图像分析软件测量脑梗死面积,计算梗死面积百分比,梗死面积百分比= 各脑切片白色缺血区面积之和/各脑切片面积之和× 100% ｡
1.6 脑含水量检测
大鼠再灌注48 h 后,在七氟烷深麻醉下迅速断头取脑,并分离梗死侧大脑半球,用电子天平测量此时重量,即为湿重;并在80 ℃的电烘箱中干燥48 h后,记录此时重量,即为干重｡计算脑含水量:脑含水量= (湿重-干重)/湿重×100% ｡
1.7 Western blot 检测
大鼠再灌注48 h 后,在七氟烷深麻醉下迅速断头取脑,然后收集梗死侧大脑皮质组织用于蛋白质分离和分子分析｡取每只大鼠左侧梗死区皮质,加入放射免疫沉淀法(radio immunoprecipitation assay,RIPA)裂解液(碧云天生物技术有限公司,中国),组织匀浆4 ℃下14 000 r / min(离心半径30 cm)离心20 min,收集上清液,并通过二喹啉甲酸(bicinchoninicacid,BCA)蛋白质定量试剂盒(碧云天生物技术有限公司,中国)检测蛋白浓度｡然后,用10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE,碧云天生物技术有限公司,中国)分离蛋白样品,并转移到硝化纤维素膜上｡用0. 1% 的Tris-Hcl 缓冲液-Tween 20 (Tris-buffered saline-Tween 20,TBST,Biosharp,中国)配置5%的脱脂奶粉进行封闭｡一抗如下:兔抗大鼠β-actin,兔抗大鼠Caspase-1,兔抗大鼠ASC｡4 ℃过夜孵育一抗,用TBST 洗涤硝化纤维素膜,室温孵育二抗,即山羊抗兔辣根过氧化物酶结合的二级抗体(1∶ 5 000;ZSGB biotechnology,中国)1 h｡用电化学发光试剂盒(碧云天生物技术有限公司,中国)和凝胶成像系统(上海勤翔科学仪器有限公司)采集和分析条带灰度值｡
1.8 ELISA 检测
大鼠再灌注48 h 后,在七氟烷深麻醉下,穿刺股动脉采集血液,血液在4 ℃下以3 000 r/ min 的速度离心15 min 获得血清｡根据制造商的说明,用ELISA 试剂盒检测血清中炎性因子IL-1β､IL-18浓度｡
9 神经功能评分
1. 9. 1 改良神经功能缺损评分(modified neurologicalseverity scores,mNSS):大鼠脑缺血-再灌注后1､3､5､7 d 时,采用mNSS 对大鼠进行神经功能评估,其评分内容包括:提尾实验,置地活动实验,平衡木实验,反射及反常运动试验[9]｡mNSS 评分为取各项测试评分之和,最低分0 分,最高分18 分,得分越高表明神经功能越差｡
1. 9. 2 Garcia 评分:大鼠脑缺血-再灌注后1､3､5､7 d时,采用Garcia 评分对大鼠进行神经功能评估[11],其评分内容包括:笼中自主活动5 min,四肢活动的对称性,拽尾时前肢伸展对称性,爬鼠笼壁,触碰躯干反应,触须反应｡Garcia 评分为取6 项测试评分之和,最低分3 分,最高分18 分,得分越低神经功能越差｡
10 体质量变化情况
记录大鼠脑缺血前体质量,即初始体质量;记录再灌注后1､3､5､7 d 体质量,即当日体质量｡计算大鼠体质量变化率:体质量变化率=当日体质量/初始体质量×100% ｡
1.11 生存率变化情况
记录大鼠每日存活情况,绘制大鼠生存曲线｡大鼠生存率=大鼠存活数/大鼠总数×100% ｡1. 12 统计学分析应用SPSS 21. 0 统计学软件进行分析｡正态分布的计量资料以x- ± s 表示,组间比较采用单因素方差分析,不同时间点组间各指标的整体比较采用重复测量方差分析;Kaplan Meier 生存曲线比较采用log-rank 检验｡以P <0. 05 为差异有统计学意义｡
2 结果
2. 1 脑梗死面积测定和脑含水量检测结果
如图1,表1 所示,与S 组比较,M 组脑梗死面积及脑含水量明显增加(均P < 0. 05);与M 组比较,H 组脑梗死面积及脑含水量明显减少(均P <0.05)｡
2. 2 脑组织Caspase-1 和ASC 的检测结果
3 组大鼠(每组6 只)缺血-再灌注后48 h,脑组织Caspase-1､ASC 表达水平差异有统计学意义(F 值分别为107. 10､100. 70,均P <0. 01)｡与S 组比较,M 组脑组织Caspase-1､ASC 表达水平显著增加(均P <0. 05);与M 组比较,H 组脑组织Caspase-1､ASC 水平明显降低(均P <0. 05)｡见图2｡
2. 3 IL-1β 和IL-18 的检测结果
3 组缺血-再灌注48 h,血清中IL-1β 和IL-18 表达水平差异有统计学意义(F 值分别为65. 58､59. 36,均P <0. 01)｡与S 组比较,M 组IL-1β 和IL-18 水平显著上升(均P <0. 05);与M 组比较,H 组IL-1β和IL-18 水平明显降低(均P <0. 05)｡见表2｡
2. 4 mNSS 评分和Garcia 评分结
与S 组比较,M 组大鼠缺血-再灌注后1､3､5､7 d时,mNSS 明显升高,Garcia 评分明显减低;与M 组比较,H 组大鼠缺血-再灌注后1､3､5､7 d 时,mNSS明显减少,Garcia 评分明显升高,差异均有统计学意义(均P <0. 05=｡见表3｡
2. 5 体质量变化率和生存率
如表4,图3 所示,S 组大鼠体质量无降低且逐渐增加,H､M 组大鼠体质量均先减低再恢复,H 组大鼠再灌注后体质量减低幅度小于M 组,且早于M 组恢复至初始水平｡
大鼠死亡集中于再灌注后24 h 内,共有8 只大鼠死亡,M 组死亡6 只,H 组死亡2 只,S 组大鼠无死亡｡两组大鼠生存率比较结果显示,H 组大鼠生存率高于M 组大鼠(P =0. 0272)｡见图4｡
3 讨论
本实验结果显示,吸入高浓度氢气(42% H2 -21% O2 -37% N2)可以显著减轻大鼠脑梗死及水肿程度,下调神经细胞焦亡相关蛋白的表达水平,降低炎性因子水平,改善大鼠神经转归｡在一定程度上,也存在提高大鼠生存率及改善体质量的趋势｡这些结果表明,吸入42%氢气对大鼠脑缺血-再灌注损伤具有神经保护作用｡
在细胞焦亡过程中,Caspase-1 活化以及其下游蛋白ASC 寡聚化,导致细胞内炎性小体大量生成,促进IL-1β 和IL-18 等炎性因子释放,造成组织炎性浸润[12]｡组织炎性浸润是脑缺血-再灌注区域神经功能受损和脑组织水肿的主要因素[13-14]｡与此同时,脑缺血-再灌注区域炎性因子浸润､微血栓形成,还可导致血-脑屏障通透性增加,进一步诱导炎性反应级联放大,诱发神经细胞焦亡｡因此,细胞焦亡是脑缺血-再灌注损伤的重要致病因素,也是脑缺血-再灌注损伤的重要环节｡本研究结果显示,大鼠脑缺血-再灌注后Caspase-1 和ASC 表达水平明显升高,炎性因子IL-1β 和IL-18 水平也明显升高｡而吸入高浓度氢气后,细胞焦亡相关蛋白Caspase-1 和ASC 的表达水平显著降低,下游炎性因子明显减少,神经功能显著好转,说明高浓度氢气可抑制细胞焦亡,减轻炎性反应,对脑缺血-再灌注损伤大鼠发挥神经保护作用｡本研究聚焦于细胞层面,探索神经细胞焦亡水平,并结合炎性因子等宏观层面的检测指标,从微观及宏观两个层面对大鼠脑缺血-再灌注损伤的相关机制进行探索,以期为缺血性卒中寻找新的治疗靶点｡与此同时,本研究在细胞焦亡方面仅检测Caspase-1､ASC､IL-1β 和IL-18 4 项主要指标,NOD 样受体3 等其他相关因素并未探索,这也将是本课题组未来深入研究的方向｡
氢气是一种无色无味无毒无害的气体,近年来备受国内外研究者关注｡作为一种医学气体,氢气可以发挥多种生物学作用,如抑制氧化应激反应[15],减轻炎性反应等[16]｡课题组前期研究结果表明,吸入高浓度氢气可以改善脑创伤后的神经功能[9,17]｡而在脑缺血-再灌注损伤过程中,有关研究显示,吸入高浓度氢气可抑制神经细胞凋亡,抑制氧化应激､炎性反应,发挥神经保护作用[18]｡此外,大鼠腹腔注射富氢水可显著减轻缺血-再灌注后脑组织损伤,改善神经功能[19]｡而本实验观察到高浓度氢气可抑制细胞焦亡,降低炎性反应,改善脑缺血-再灌注损伤大鼠的预后｡既往研究表明,氢气在抗氧化应激反应[15]､抗凋亡[18]等宏观层面发挥效用｡但在微观层面上,氢气机制的探索却相对较少,这也是氢气的作用机制不够深入､明确的原因之一｡其具体如何发挥作用犹如“黑箱理论”,相信这也是除易爆性以外,氢气向临床转化的一大障碍｡
本研究在宏观和微观两个层面上对氢气发挥神经保护作用及其可能机制进行了一次探索,从细胞焦亡层面阐释了氢气对缺血性卒中的改善作用及机制,并侧面辅证了氢气可减轻炎性反应,不仅为相关研究提供理论依据,也是氢气作用机制向微观层面深入的一次尝试性探索｡与此同时,采用42%的氢气进行实验,也是本次研究不同于以往之处｡本课题组的另一研究显示,吸入高浓度(42% )氢气可改善创伤性脑损伤的神经功能,但低浓度氢气(3% )对创伤性脑损伤的神经功能无改善作用[9]｡高浓度氢气的作用机制与低浓度氢气是否存在差异仍需在未来进一步深入､明确｡另一方面,本次研究发现氢气对缺血性卒中后7 d 神经功能转归改善明显的同时,也监测了大鼠体质量及存活情况,拟为氢气向临床转化及应用于缺血性卒中患者提供理论基础,但毕竟大鼠与人类间存在差异,且从生存周期上很难精准模拟临床1 ～3 个月的周期,这也是本次研究亟待改进之处｡
综上所述,吸入高浓度氢气(42% )可以改善大鼠脑缺血-再灌注损伤后神经功能,促进神经功能转归,改善预后,其作用机制可能与皮质区神经细胞焦亡的抑制以及炎性因子的表达下降相关｡
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