卒中是全球范围内的第二大病死原因及第三大致残原因^[1],严重影响居民健康和生活质量,溶栓和机械取栓等治疗方法存在治疗时间窗狭窄､禁忌证较多等不足^[2]｡随着干细胞研究的不断深入,以神经干细胞(neural stem cells,NSCs)为代表的细胞疗法在卒中的治疗中展现出巨大的潜力｡NSCs 能自我更新,具有多分化潜能,可促进神经发生､血管生成并替换脑组织受损或死亡的细胞^[3],因此,NSCs移植疗法已被纳入卒中治疗的基础和临床研究,以期为患者提供再生医学的治疗策略｡此外,为了更好地研究干细胞的治疗机制､评估其疗效,通过磁对比剂标记细胞进行MRI,已成为细胞定位及追踪的重要手段｡

笔者对NSCs 移植治疗卒中的作用机制､研究现状和研究热点以及磁对比剂标记干细胞的研究进展､应用前景进行了综述｡

NSCs的“旁观者效应”指其移植后通过旁分泌功能产生的神经营养因子､细胞因子､微囊泡等物质发挥神经保护､促血管生成､免疫调节､抗炎､抗氧化应激等作用^[7],如NSCs分泌的脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)可促进卒中后的神经发生､血管生成,发挥神经保护作用^[8]｡血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)也可促进新生血管生成,并具有抗炎作用^[9]｡研究表明,NSCs分泌的VEGF主要通过激活星形胶质细胞中的磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B通路上调谷氨酸转运蛋白1的表达,进而降低细胞外的谷氨酸浓度,改善神经损伤,抑制VEGF则会使NSCs的神经保护作用显著下降^[10]｡另有研究使用普通培养基和培养NSCs之后的培养基分别培养大鼠海马切片并诱导低氧损伤,结果显示,培养过NSCs的培养基中的海马角损伤体积明显小于普通培养基(P<0.05),其神经保护作用来源于NSCs旁分泌所产生的VEGF､神经生长因子､胶质细胞源性神经营养因子等物质^[11]｡

NSCs移植治疗卒中的方法主要包括颅内立体定向移植､血管内途径及脑脊液途径^[12]｡颅内立体定向移植可使更多的NSCs分布到脑损伤区域,因此大多临床前研究选择了该方法,但该方法为侵入性手段,存在颅内出血､感染及脑水肿等并发症的风险,将其应用于临床研究时应谨慎^[3]｡血管内注射移植相较其他方法具有操作简单､创伤小､风险低等优点^[12]｡研究表明,NSCs在动脉注射移植1周之后,93%分布至大脑,而静脉注射移植后,超过90%的细胞被困于肺内^[13],但动脉注射移植仍然存在血管闭塞风险^[14]｡脑脊液途径包括脑室移植和腰椎穿刺移植,移植细胞可通过脑脊液循环至整个大脑,适用于脑组织大面积损伤患者的治疗^[12]｡

目前已有研究探索了NSCs 移植治疗卒中的最佳移植时间点｡有研究表明,卒中后48h移植NSCs存活率高于卒中后6周(58%比27%,P<0.05),但移植细胞增殖率的差异无统计学意义(P>0.05),移植物中增殖细胞比例在移植后5周均下降至约1%^[15]｡将小鼠NSCs(5×105个)通过颈总动脉分别移植到缺氧､缺血后6h､24h､3d､7d､14d的动物体内,结果显示,移植后1周存活的NSCs分别为1.01 ×105､1. 89×105､2.99×105､6.64×104､6.37×104个,即缺氧､缺血后3d移植的细胞存活率最高,且与其他时点的差异均有统计学意义(均P<0.01)^[16]｡同时该研究表明,早期移植(24 h 内)会导致NSCs 向星形胶质细胞分化的程度更高,而1~2周内移植则使其向神经元的分化程度更高^[16],说明不同移植时间点也会影响NSCs在宿主体内的分化。

综上所述,选择恰当的移植方式及移植时间是细胞疗法的关键步骤,但目前尚无公认的最佳移植时间点｡研究表明,缺血性卒中后3h可能是移植最佳时机^[17],但这在临床治疗上较难实现,一方面移植细胞的准备时间不足,另一方面患者在卒中急性期接受移植治疗的潜在风险相对较高｡目前大多数临床前研究在卒中后2~3d内进行NSCs 移植,可避开急性期大量的兴奋性毒性分子和宿主环境中的急性炎性反应^[7]｡

为评估NSCs移植治疗卒中的安全性及有效性,目前已进行了大量临床前研究,大多数研究以啮齿类动物为模型｡一项荟萃分析表明,大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)啮齿类模型经过NSCs 移植治疗后,神经功能得到明显恢复,该疗法对改良神经功能缺损评分和梗死体积的平均效应量分别为1.35和0.84^[18]｡NSCs移植对出血性卒中的疗效同样被研究证实^[19]｡但相较于非人灵长类动物,啮齿类动物与人类大脑解剖结构及神经生理相差甚远,不利于研究成果的临床转化｡有研究表明,在未进行免疫抑制治疗的情况下,移植入非人灵长类动物脑中的人NSCs可以正常存活并分化为神经元,且无致瘤性^[20],这为后续相关研究的进一步开展打下了良好的基础｡此外,一项以猪作为卒中模型的研究通过MRI随访表明,NSCs可促进梗死侧白质完整性､脑血流灌注及脑代谢的恢复^[21],进一步论证了NSCs 移植对缺血性卒中的良好疗效。

组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)溶栓治疗时间窗狭窄是卒中患者溶栓治疗的主要障碍｡研究表明,MCAO 组､MCAO +延迟t-PA(卒中后6h)治疗组､MCAO+延t-PA治疗+ NSCs移植(卒中后24 h)组小鼠卒中后48h的梗死体积分别为46.05%､49. 75%､33.80%,肿瘤坏死因子水平分别为假手术组的46､51､29倍^[22],表明NSCs 移植可与现有的溶栓疗法协同,扩大其治疗时间窗,使更多卒中患者受益｡Hartman等^[23]发现,只有MRI证实存在缺血半暗带时,植入的NSCs才能改善缺血损伤及运动功能,并降低缺血半暗带发展为不可逆的梗死核心的风险｡这可用于指导临床治疗,若患者不存在明显的缺血半暗带,则不宜行NSCs移植治疗。

目前已有研究结果表明,移植的神经元可与宿主神经元建立功能性联系^[24]｡有研究将表达钙离子指示剂GCaMP6的NSCs移植入脊髓损伤的小鼠,结合光敏感蛋白发现,对移植物内来源于宿主的皮质脊髓束轴突的光遗传刺激可在整个移植物中引起神经元反应,对宿主失神经脊髓中源于移植物的轴突的光遗传刺激也触发了局部宿主神经元反应,此外,对宿主的行为刺激同样能引起移植物内的局灶性突触反应^[5]｡这表明宿主神经网络与移植细胞之间形成了功能整合,增加了该疗法临床转化的可能。

鉴于NSCs移植对卒中动物模型的良好疗效,NSCs移植治疗卒中的临床试验也得以开展,但目前主要集中于慢性缺血性卒中的治疗｡一项研究纳入了11例男性慢性缺血性卒中患者,美国国立卫生研究院卒中量表(NIHSS)评分均≥6 分,接受基于人永生化NSCs系而开发的药物CTX-DP同侧壳核立体定向移植术后24个月的随访结果显示,患者的NIHSS 评分下降了0~5分(平均值为2分),Barthel指数及Ashworth量表评分也呈现改善趋势,且未出现与移植细胞相关的严重不良事件^[25]｡另有研究招募了9 例慢性缺血性卒中致偏瘫患者,接受NSCs候选新药物NSI-566治疗,其为一种来源于人类胎儿脊髓组织的NSC系^[26],患者被随机分为3 组,每组分别注射1.2×107､2.4×107､7.2×107个细胞(NSI-566)于脑内,在细胞移植术后为期12个月的随访中,9 例受试者的Fugl-Meyer 运动评分较治疗前平均提高了16分(P=0.0078),NIHSS评分较治疗前平均下降了3.1分(P=0. 02),这证实了NSCs移植治疗慢性卒中所致偏瘫的可行性^[26]｡虽然该疗法的临床转化仍面临着诸多困难,但相信在广大研究者的共同努力下,NSCs移植疗法必将造福卒中患者｡

移植干细胞在宿主体内的活性､定位､迁移､分化等情况是对干细胞治疗安全性与有效性的重要评估内容,归巢和迁移的不确定性是干细胞治疗中存在的主要问题^[27],因此需要长期､持续有效且无创的体外监测手段｡MRI相对于其他影像技术具有无辐射､对比度大､空间分辨率高､图像类型多样等优点,是监测移植细胞的理想手段^[28]｡超顺磁性氧化铁纳米颗粒(superparamagnetic iron oxide nanoparticles,SPIONs)由于生物相容性好､对比度高､毒性低等特点,是目前常用的细胞标记MRI示踪剂^[29]｡近年来,MRI与SPIONs的联合应用已被提出作为监测植入体内的干细胞分布和迁移的金标准^[27]｡

已有研究证实,SPIONs标记的人NSCs在体外可以正常增殖分化,移植入正常或MCAO啮齿类动物体内后均表现出与未标记细胞相似的存活､迁移､整合及分化过程,MRI图像上显示的标记物与移植细胞剂量有很强的相关性,同时与组织学测量的移植物大小相似^[28,30],说明MRI可以量化移植细胞,进而监测细胞的死亡､清除(信号强度消失,移植物体积减小)｡

SPIONs不仅可用来标记细胞,还可联合外加磁场促进干细胞在宿主体内的迁移与归巢｡将其标记的脂肪干细胞立体定向移植入帕金森病大鼠模型后,在颅骨上放置0. 32 T的磁铁1周,结果显示,放置磁铁组的动物脑切片中单位面积的移植细胞显著多于未放磁铁组[(54.5 ± 1.3)个/100μm2 比(30.8 ±3.0)个/100 μm2,P<0.01],动物运动功能较未放磁铁组明显改善^[31],说明SPIONs联合外部磁场可促进靶组织中移植干细胞的输送和归巢,为提高NSCs移植治疗卒中的临床疗效提供了新的思路。

如今,作为药物､基因和显像剂载体的聚合物纳米颗粒备受关注,其具有传输效率高､毒性小､靶向性好等优点,且纳米载体具有多功能和极大灵活性,可以将治疗成分､靶向配体和成像标记物集成到一个实体中^[32]｡有研究者近年研发了一些新型的阳离子聚合物纳米粒子,可生物降解,无需转染剂,表现出无毒性､尺寸较小､铁含量多､标记效率高､示踪效果好等一系列优点,具有良好的临床转化前景^[33-34],掺入荧光染料的新型阳离子多聚体还可用于NSCs 移植后的双模态MRI 及光学成像,使其监测更加准确,同时多聚体独特的空心结构提高了其负载能力,产生的弛豫系数远远高于普通的SPIONs^[6]｡

通过使用特定基因转染细胞使其表达相应蛋白质,增强组织弛豫率,也是一种间接磁性标记方法｡有研究将编码铁蛋白重链和增强型绿色荧光蛋白的报告基因导入NSCs,从而使其移植到缺血性卒中大鼠模型后可在体内进行MRI 检查和荧光成像,实时追踪移植细胞直到移植后6周,克服了传统磁性纳米颗粒标记技术不能可靠区分细胞活性的缺点^[35]｡此外,也不断有研究探索用于MRI成像的新型报告基因,如水通道蛋白基因可通过增加组织水的扩散率从而在扩散加权成像上清楚显示移植细胞^[36]｡

基因修饰是近年来干细胞研究的热点之一,经其处理后,NSCs 具有了更强的增殖分化能力或分泌功能,局部微环境得到改善,有利于其存活并发挥治疗作用^[12]｡有研究者建立了含乙酰胆碱转移酶编码基因的人NSCs,较其亲代可产生更多的乙酰胆碱转移酶､抗炎性神经营养素,将其静脉输注到MCAO大鼠体内,卒中后48 h 的平均脑梗死体积较普通NSCs 移植组更小(平均值:4.9% 比12.5% ),且明显低于未移植组(平均值:4.9% 比29.1% ,P<0.05)^[37]｡将靶向Nogo 受体(Nogo receptor,NgR)基因的小干扰核糖核酸导入NSCs,沉默NgR基因避免其与髓鞘相关抑制因子结合,体外实验显示,NSCs分化为神经元的比例可由3%提高至约37% ,移植入脑梗死动物模型后,NSCs分化为神经元的比例也由4%提高至27%,动物神经功能明显改善^[38]｡

干细胞衍生物如胞外囊泡也有一定的治疗作用｡无细胞治疗方式可以克服目前与细胞治疗相关的一些限制,避免细胞移植带来的伦理问题｡胞外囊泡是细胞分泌或从细胞膜上脱落的纳米级膜结合囊泡,作为细胞间通信的中间环节,富含蛋白质､脱氧核糖核酸､小分子核糖核酸､非编码核糖核酸和脂质,其具有跨越血-脑屏障和血-脑脊液屏障的能力,可维持NSCs及其他干细胞增殖和分化之间的平衡,还可调节神经元和胶质细胞的功能^[39]｡将胞外囊泡注入MCAO 后2 h 的大鼠脑室,可缩小病灶体积,改善运动功能,还可减少缺血边界区的小胶质细胞和凋亡阳性细胞,增加神经元存活率^[40]｡将胞外囊泡通过尾静脉注入MCAO小鼠体内,同样使其梗死体积减小,脑萎缩减轻^[41]｡利用促炎因子干扰素γ诱导NSCs产生的外泌体在体外可促进细胞增殖,减少凋亡,在缺血性卒中大鼠模型中较普通外泌体表现出更好的疗效^[42]｡

此外,有研究开始聚焦于联合疗法^[3],如将NSCs与脑血管内皮细胞共培育后同时移植,借助内皮细胞的分泌作用发挥抗炎､突触重塑和调节细胞自噬的功能^[43]｡3K3A活化蛋白C作为缺血性卒中的神经保护剂,将其输注到已移植NSCs的小鼠卒中模型中,可刺激移植细胞产生神经元,促进神经环路的恢复及功能改善,显著提高了NSCs的疗效,为卒中的治疗提供了新的思路^[44]｡NSCs 联合人参皂甙Rg1 治疗也可明显改善脑梗死后的神经功能缺损,调节多种代谢物的水平^[45],为今后干细胞与中医药的结合研究提供了理论依据。

综上所述,NSCs移植疗法是目前治疗卒中较有潜力的方法｡近年来,基于该疗法的卒中临床前研究和临床研究日益增多,其安全性及有效性日渐得到证实,治疗机制也已初步阐明｡细胞磁性标记技术的出现实现了NSCs 移植后的实时监控和动态追踪,为其精准治疗卒中创造了有利的条件｡未来对于该疗法的临床前研究可尝试以非人灵长类动物为模型,其大脑解剖､神经生理与人体相似,同时具有复杂的运动功能,有利于疗效评估,从而加速该疗法的临床转化｡另一方面,研究干细胞的基因修饰,不仅可强化细胞功能,还可完成间接磁性标记,探索该技术的更多可能性,从而使细胞移植疗法得以进一步发展与突破｡