美国华盛顿大学西雅图儿童医院小儿血液科/肿瘤科的Nicholas A. Vitanza等采用由DIPG活检组织建立移植瘤模型，识别和验证两个新型HDACi药物，即quisinostat和romidepsin，并利用RNA测序寻找预测疗效的生物标志物。结果发表于2021年3月的《Neuro-Oncology》在线。
——摘自文章章节
【Ref: Vitanza NA, et al. Neuro Oncol. 2021 Mar 25;23(3):376-386.doi: 10.1093/neuonc/noaa249.】
弥漫中线胶质瘤（diffuse midline gliomas，DMG），包括弥漫内生性脑桥胶质瘤（diffuse intrinsic pontine gliomas, DIPG），预后不良，5年生存率低于2%，中位总生存期11个月。大多数DIPG和所有DMG都具有H3 K27M的突变；H3 K27M的表达导致组蛋白乙酰化增加和H3 K27甲基化减少。组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDACi）panobinostat，能增加组蛋白的乙酰化。多个临床试验发现，panobinostat对正常组织也有作用，而且严重的血液毒性限制其临床应用。其它一些HDACi也具有临床前或临床疗效，可能与panobinostat具有相同的抗肿瘤活性，对正常细胞毒性较低。因此需进一步评估其对DMG细胞毒性的潜在机制。美国华盛顿大学西雅图儿童医院小儿血液科/肿瘤科的Nicholas A. Vitanza等采用由DIPG活检组织建立移植瘤模型，识别和验证两个新型HDACi药物，即quisinostat和romidepsin，并利用RNA测序寻找预测疗效的生物标志物。结果发表于2021年3月的《Neuro-Oncology》在线。研究者采用DIPG活检组织建立NSG小鼠颅内原位和裸鼠侧方皮下软组织移植瘤模型；并在体外和体内DMG模型中检测HDAC抑制剂（包括panobinostat、quisinostat、vorinostat、entinostat、romidepsin和CAY10603）的抗肿瘤活性及组蛋白乙酰化的水平。最后通过RNA测序检测HDAC抑制剂诱导DMG模型中共同的RNA差异表达，寻找可预测疗效的生物标志物。研究结果发现，4例影像学典型的DIPG，其组织病理H&E染色均为高级别胶质瘤，3例H3 K27M免疫组化染色阳性。研究建立PBT-09FH、PBT-22FH、PBT-24FH和PBT-27FH DMG肿瘤模型。2例经标准放疗并出现早期进展的患者，PBT-22FH和PBT-24FH肿瘤的PFS分别为121天和79天；OS分别为190天和222天。另2例PBT-09FH和PBT-27FH肿瘤患者的PFS和OS相对较长，PFS分别为284天和288天；OS分别为468天和544天。通过体外实验进一步评估原代细胞的放疗抗性，经0-32Gy处理原代肿瘤细胞，PBT-22FH和PBT-24FH肿瘤在32Gy下的存活率分别为69.1%和78.1%，PBT-09FH在相同条件下的存活率仅为32.6%；髓母细胞瘤患者的MED-411FH细胞比DMG模型对放疗更加敏感，细胞活力之间具有显著性差异（P=9.03e-6）。
体外研究表明，panobinostat、quisinostat和romidepsin在生物学相关剂量下比其它HDACi更能降低细胞（PBT-09FH、PBT-22FH、PBT-24FH和PBT-27FH）的活力。PBT-09FH细胞中，panobinostat、quisinostat和romidepsin的半数最大抑制浓度（IC50）值分别为34nM、60nM和0.39nM，显著低于其它HDACi（P分别=0.008、0.0001和6.1E-6）。处理多种肿瘤细胞，quisinostat和romidepsin处理后的平均IC50值分别为24.8nM和1.26nM。quisinostat和romidepsin处理的PBT-09FH和PBT-22FH细胞的time course分析显示细胞活力显著降低。
流式细胞凋亡分析显示，经quisinostat处理的PBT-22FH细胞的早期凋亡比例明显高于对照组（67.4%比15.3%）。免疫印迹显示panobinostat和quisinostat处理PBT-09FH和PBT-22FH细胞后裂解的PARP表达呈剂量依赖性增加。由于HDAC6对α-微管蛋白乙酰化的调节与血细胞减少症的发展有关，结果显示panobinostat和CAY10603（阳性对照）引起乙酰化α-微管蛋白的水平呈剂量依赖性增加，而quisinostat和romidepsin不引起表达的变化。time course试验也表明，用50nM romidepsin处理PBT-22FH细胞不影响乙酰化α-微管蛋白的水平。采用无胸腺小鼠建立原位异种DMG移植瘤模型，quisinostat（10mg/kg周一、周三、周五 MWF）腹膜内（intraperitoneal，IP）给药，在最后一次给药3小时后安乐死小鼠评估组蛋白3乙酰化水平，作为肿瘤内疗效的指标。用quisinostat治疗后肿瘤内组蛋白3乙酰化水平未增加。在原位异种移植PBT-09FH模型中，HDACi无法有效穿透原位DMG肿瘤模型。因而，通过PBT-09FH细胞皮下移植瘤DMG模型，可作为评估体内疗效的替代方法。
DMG皮下移植瘤体内试验显示，经quisinostat剂量为10mg/kg MWF，romidepsin剂量为1mg/kg MF处理荷瘤小鼠，能增加乙酰化水平，说明quisinostat和romidepsin具有肿瘤穿透性。荷瘤小鼠生存分析显示，对照组有6只小鼠因肿瘤负荷过大（≥1000mm³）退出研究，而在quisinostat或romidepsin组中均未出现此现象。与对照组相比，quisinostat和romidepsin治疗均能抑制小鼠肿瘤生长，在研究终点时，肿瘤中位体积分别为270.5mm³和384.5mm³（P＜0.0001）；说明quisinostat和romidepsin全身给药可耐受，并且能在体内延长对肿瘤的控制时间。
应用最常见的分子亚型PBT-22FH进行RNA-Seq差异表达分析，研究panobinostat、quisinostat和romidepsin是否诱导类似的转录组变化。非监督层次聚类显示panobinostat和quisinostat之间具有相似的基因表达变化，在每个剂量水平重叠。对3个药物浓度进行分层聚类，发现在每个剂量的quisinostat和panobinostat的转录变化之间存在高度相关性，而所有3个剂量的romidepsin都独立地聚类。较小的基因子集，包括TNNT1和COL20A1，与3种药物都相关。在3种药物治疗中，SMIM24和TNNT1均上调，而COL20A1和IFITM3下调。panobinostat和quisinostat处理后5个基因上调：FSTL5、ITIH5、SMIM24、SLC17A6和GLRA3。FSTL5和ITIH5（P＜0.001）是50nM和100nM panobinostat和quisinostat处理后上调最多的2个基因。在100nM quisinostat剂量下，FSTL5和ITIH5表达增加超过1000倍。有3个下调幅度最大的基因：GPR37L1、C6orf15和HEPACAM。在RNAseq数据中识别的转录组变化通过靶向TaqMan定量PCR验证，显示高相关性（FSTL5和ITIH5的Pearson相关系数分别为0.976和0.979）。
该研究建立未经治疗的活检组织DMG模型，该模型具有生物学相关的放疗抵抗和血脑肿瘤屏障；并证明HDAC抑制剂quisinostat和romidepsin在体内具有DMG细胞毒性；转录分析揭示，HDAC抑制剂panobinostat和quisinostat与romidepsin之间的关键重叠和不同特征基因，TNNT1的上调或COL20A1的下调可能作为HDAC抑制剂诱导死亡的临床生物标志物。总之，该研究结果阐明HDAC抑制剂诱导DMG细胞死亡的潜在机制；同时作者强调需要开发潜在的能透过脑肿瘤屏障的有效药物。
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