在肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）中，肿瘤细胞与非肿瘤免疫细胞和基质细胞间的相互作用不仅影响肿瘤发生和发展，还影响肿瘤的耐药性。由小胶质细胞（brain-resident microglia，MG）和单核细胞源性巨噬细胞（monocyte-derived macrophages，MDMs）组成的肿瘤相关巨噬细胞（Tumor-associated macrophages，TAM）集聚与胶质瘤患者预后不良相关。电离辐射（ionizing radiation，IR）结合替莫唑胺化疗作为胶质母细胞瘤（GBM）术后标准治疗，其疗效短暂，复发率高。研究表明，IR的疗效受肿瘤细胞固有抵抗以及外在耐药机制影响。靶向巨噬细胞的抗肿瘤药物，如集落刺激因子受体（colony-stimulating factor–1 receptor，CSF-1R）已用于制作小鼠胶质瘤模型；并结合标准治疗或免疫检查点抑制剂治疗胶质母细胞瘤患者。瑞士洛桑大学肿瘤科的Leila Akkari等在转基因小鼠胶质瘤模型中研究IR如何改变GBM中的TAM的行为，并展示CSF-1R重编程后对肿瘤复发的影响。结果发表在2020年7月的《Sci Transl Med》在线。

作者分别在缺乏P53（PDG-p53 KD）和Ink4a/Arf（PDG-Ink4a/Arf KO）抑癌基因小鼠胶质瘤模型中进行分割放疗（2Gy/天，5天共10Gy）；通过使用Flt3:Cre和Rosa26:mTmG髓系细胞谱系追踪模型。在该模型中，外周募集的MDM呈绿色荧光蛋白阳性（green fluorescent protein–positive，GFP⁺），而来自卵黄囊前体的MG呈GFP−，产生Frce。结果表明，Frce和PDG-p53 KD小鼠经5d-IR处理后，肿瘤短暂生长。而PDG-Ink4a/Arf KO小鼠可见肿瘤明显缩小。IR导致Ki67+增殖细胞减少，而凋亡裂解caspase-3阳性细胞（caspase 3–positive，CC3+）随着时间的推移逐渐增加。在5d-IR后期，观察到TAM（由巨噬细胞标记物Iba1检测）集聚。经5d-IR治疗后，PDG-Ink4a/Arf KO和PDG-p53 KD组小鼠肿瘤进入一个静止的、可控期。此期MRI未检测到肿瘤增长迹象。与对照组相比，IR治疗延长小鼠生存期：PDG-Ink4a/Arf KO、PDG-p53 KD和Fcre、PDG-p53 KD组小鼠中位生存期分别为10.42:7.85周、8.98:6.57周和8.57:5.85周。然而，肿瘤最终在所有小鼠中复发，表明放疗在延长胶质瘤模型动物生存效果欠佳。

IR治疗后以及复发时，分析MDM与MG比例动态变化发现，在复发肿瘤中有大量GFP⁺MDM。不同小鼠胶质母细胞瘤模型中，MDM与MG的基线比值不同，MDM在PDG-p53 KD对照组小鼠肿瘤中占30%-40%,而在PDG-Ink4a/Arf KO中仅占10%-20%。对5d-IR组与21d-IR组分析，与对照组相比，尽管TAM总数在5d-IR组中增加，但MDM与MG比例仍保持不变。与未治疗的对照组和5d-IR相比，复发肿瘤组中可观察到MDM增加，占比超TAM总数的50%，而MG含量降低。免疫荧光染色显示，这种比例变化为复发胶质瘤所特有，而在21d-IR组并未观察到。同时，还在Frce、p53 KD模型中验证该结果。复发PDG-Ink4a/Arf KO小鼠中MDM与MG比例变化与中性粒细胞和单核细胞增加有关。与对照组相比，总CD3⁺淋巴细胞未受IR治疗影响，IR后复发肿瘤的CD4/CD8 T细胞和活化表型未见改变。

研究表明，由循环的单核细胞来源的巨噬细胞浸润可促进IR后复发肿瘤的新生血管形成。作者使用不干扰内在MG的CD49d中和抗体（α-CD49d）阻断MDM积聚。单用α-CD49d对延长动物生命效果甚微。与IR+IgG治疗相比，在PDG-Ink4a/Arf KO和PDG-p53 KD模型中，IR+α-CD49d可延长生存期（中位生存期分别为11周:9.92周、12.92周:9.2周）。IR+α-CD49d治疗PDG-Ink4a/Arf KO复发肿瘤时，肿瘤细胞增殖未见明显变化；与21d-IR组相比，治疗组的Ki67⁺在21天时减少。两种模型中，IR+α-CD49d治疗提高肿瘤浸润CD4⁺和CD8⁺T细胞的标志物CD69表达，降低中性粒细胞免疫抑制表型。与PDG-Ink4a/Arf KO模型相比，PDG-p53 KD模型中，IR+α-CD49d延长生存周期的机制是α-CD49d对阻断MDM集聚更有效，此外，与单独IR治疗相比，在PDG-p53 KD模型中IR+α-CD49d治疗复发肿瘤表达GrzB的CD8⁺T细胞数量增加。综上所述，在IR处理后阻断MDM浸润可部分缓解胶质瘤TME的免疫抑制特性，呈中等程度延迟IR后肿瘤复发，尤其是在PDG-Ink4a/Arf KO模型中更明显。

鉴于单独阻断MDM的疗效有限，作者使用一种可通过血脑屏障的酪氨酸激酶抑制剂BLZ945阻断TAM集聚。在PDG-Ink4a/Arf KO和PDG-p53 KD小鼠模型中，均发现联合治疗优于单独治疗。与单一治疗组相比，联合治疗组肿瘤体积缩小与细胞凋亡增加和增殖细胞减少有关。联合治疗组中，单核细胞和淋巴细胞数量没有变化，但中性粒细胞数量增加。与对照组相比，IR组和IR+BLZ945组未出现TAM总数变化，MG仍然是IR+BLZ945早期反应阶段的主导细胞群。在DNA损伤研究中，与对照组相比，IR+BLZ945组的γH2aX标记肿瘤细胞增加。使用单个10-Gy辐射剂量时，肿瘤细胞γH2aX和P53磷酸化增加。相比之下，共培养时，巨噬细胞削弱肿瘤细胞的DNA损伤传感器的激活，而CSF-1R抑制恢复对IR的敏感性。在IR处理前，肿瘤细胞在巨噬细胞条件培养基（conditioned medium，CM）培育24小时，也可观察到类似的效果。单一培养时，从对照组与IR后复发肿瘤中分离出的肿瘤细胞的增殖能力相似；对照组接受10GyIR处理，可降低肿瘤细胞增殖能力。在共培养过程中，MG比MDM更可能促进肿瘤细胞的增殖。在经过IR处理的对照组和复发肿瘤细胞中，TAM均促进耐药和细胞增殖。当培养基中加入BLZ945时，MG对对照组肿瘤细胞和TAM对复发肿瘤细胞的促增殖作用减弱；表明MG和MDM均限制放疗的疗效，并为脑胶质瘤IR后复发提供条件。

作者在IR结合BLZ945治疗5天后，继续给予BLZ945治疗1周，验证IR治疗时CSF-1R对TME的抑制持续存在。PDG-Ink4a/Arf KO小鼠单独接受BLZ945急性治疗12天；与单药相比，IR结合急性BLZ495可明显缩小肿瘤体积，并延长小鼠生存期（中位生存期13.86周﹕10.2周或9.07周）。治疗21天后增殖分析表明，IR结合急性BLZ495使Ki67⁺胶质瘤细胞减少。不同治疗组的复发肿瘤中TAM总量相当；但与单独IR相比，IR+BLZ495治疗的胶质瘤的MDM减少，MG增加，单核细胞数量减少，而中性粒细胞和淋巴细胞没有变化。综上所述，与单纯阻断MDM浸润的IR结合α-CD49d治疗相比，短期使用靶向MG和MDM的CSF-1R抑制可提高IR疗效并延迟肿瘤复发。

研究将未治疗的年龄匹配的肿瘤患者作为对照组，与经5d-IR处理的PDG-Ink4a/Arf KO小鼠肿瘤中筛选出来的MG（CD49d⁻CD11a⁻）和MDM（CD49d⁺CD11a⁺）进行RNA测序。与对照组相比，发现实验组肿瘤的一组在MG和MDM中均上调64个基因，称之为“TAM-IR”转录特征。基序富集的超几何优化（hypergeometric optimization of motif enrichment，HOMER）分析和基因本体分析显示，P53基序和P53转录靶点的富集与细胞周期调控基因减少有关。与对照组相比，在5d-IR治疗肿瘤的MDM显示比MG更强的转录可塑性（710个:125个基因特异性上调）。单独使用BLZ945并没有改变TAM-IR基因的表达，而IR 结合BLZ945治疗5天的MG和MDM的特征减弱；结果表明，CSF-1R抑制可阻断TAM群体IR介导的初始表达变化。应用定量逆转录聚合酶链反应（quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，qRT-PCR）分析两组独立的MG和MDM，结果表明BLZ945逆转IR诱导的TAM-IR替代激活基因的上调。综上所述，研究结果表明，IR处理能迅速诱导MG和MDM的异质致瘤表型。CSF-1R靶向阻断两种细胞类型的IR特异性特征，包括它们的替代激活，这与胶质瘤细胞凋亡增加、DNA损伤致敏和肿瘤减瘤相关。在治疗的早期靶向巨噬细胞药物可增强辐射反应。

在MG和MDM转录程序分析中，作者观察到MG和MDM之间与个体起源相关的基因表达差异。在MDM中富集的基因，包括用于区分MDM和MG的细胞表面蛋白Itga4 （CD49d）和Itgal（CD11a），而MG中富集个体发育标记的Siglech、P2ry12、Jam2、Sall1和Tmem119基因；描述不同起源的核心MG和MDM个体发育特征能在IR反应至肿瘤复发过程中维持。在复发胶质瘤中，MG和MDM的表达发生相当大的变化，导致转录程序在复发时被调控。分析表明，MDM能始终保持其个体发生特征，但在复发时表现较低的胶质瘤特异性特征的富集，并获得MG样特征；大部分IR后复发肿瘤的上调基因在对照组分离的MG中已经高表达，同时也在MDM高表达。白细胞通过血脑屏障外渗的重要介质（Vcam1）在复发肿瘤MG和MDM中表达均上调。因此，胶质瘤特异性特征的变化反映两种TAM群体复发时的可塑性。尽管如此，复发肿瘤中的MG和MDM表型不同于它们各自的基线状态，并显示对亚型特异性胶质瘤特征的调节，而不同于初始接受辐射而产生的简单变化。

作者集中研究两种细胞群共有的693个上调基因，确定MG和MDM在复发时调控的转录调控因子。全基因组转录因子活性分析发现，SMAD和RBPJ在复发性肿瘤中富集；HOMER分析证实SMAD结合基序的富集。SMAD和RBPJ上游信号通路、转化生长因子（TGF-β）和Notch分别与MG或MDM稳态维持或免疫抑制表型有关。研究结果显示，251和118个SMAD和RBPJ靶基因是复发性胶质瘤MG和MDM共有的417个基因的一部分。其中78个基因受这两种转录因子的调控，提示肿瘤复发时TAM中TGF-β和Notch信号通路交叉。在复发肿瘤患者的样本中，对MG和MDM进行分类，并RNA测序。在胶质瘤小鼠模型发现几个RBPJ和SMAD靶基因在复发肿瘤患者分离出来的MG和MDM中表达增加，包括CXCR4、vldllr和NRXN2。研究者分析7对未治疗与经30次2gy IR结合替莫唑胺化疗后复发胶质母细胞瘤的组织切片，尽管样本中CD68+ TAM的数量相当，但P2RY12+ MG的数量在复发肿瘤内减少。

分析IR结合长期使用CSF-1R结果发现，在肿瘤得到控制起，绝大多数的肿瘤处于静止状态，直到实验终止；与单独使用IR治疗的小鼠相比，接受结合治疗的小鼠生命显著延长，中位生存期25.85周:10.42周。在使用相同的临床前试验设计条件下，BLZ945单药治疗的中位生存期为20.85周，低于IR+BLZ945治疗的25.85周。实验终结后的组织学分级分析表明，80%的IR +BLZ945治疗小鼠无肿瘤残留的证据。用目前标准的IR+替莫唑胺治疗PDG-Ink4a/Arf KO胶质瘤小鼠只产生中等程度的生存效果（中位生存期9.5周）。为进一步评估靶向巨噬细胞药结合IR的治疗潜力，作者使用患者来源的肿瘤球（TS573）或人胶质瘤细胞系（U251）进行原位异种移植实验。用IR+BLZ945分割处理小鼠模型，结果在TS573荷瘤小鼠在28天试验中，没有发生肿瘤再生。总的来说，这些临床前结果证明了IR+BLZ945优于当前标准治疗。

作者认为，CSF-1R抑制剂可以通过阻断IR诱导的MG和MDM，替代激活增强放疗的胶质瘤缩小体积。该研究提供不同TAM细胞亚型在治疗中的动态变化过程，对肿瘤联合治疗具有重要意义。