NEO100能够向大脑传递血脑屏障不可渗透的治疗药物

美国南加利福尼亚州大学神经外科的Weijun Wang等研发经动脉注射一种天然的高度纯化单萜类物质紫苏醇，可以安全、有效、可控、快速和可逆打开BBB，而且无不良反应。结果发表于2020年9月的《Neuro-Oncology》在线。

——摘自文章章节

【Ref: Wang W, et al. Neuro Oncol. 2020 Sep 2;noaa206. doi: 10.1093/neuonc/noaa206. [Epub ahead of print]】

研究背景

血脑屏障（BBB）维持中枢神经系统（CNS）的稳定，但阻碍抗肿瘤药物进入CNS，不利于发挥药效。数十年来，经颈动脉注射甘露醇能够向大脑传递不可渗透BBB的药物。但是，该方法操作复杂而且风险较高，可引发癫痫、脑动脉栓塞、脑出血和脑水肿，限制其推广应用。因此，亟待寻求一种安全、快速的方法开放BBB。美国南加利福尼亚州大学神经外科的Weijun Wang等研发经动脉（IA）注射一种天然的高度纯化单萜类物质紫苏醇（NEO100），可以安全、有效、可控、快速和可逆打开BBB，而且无不良反应。结果发表于2020年9月的《Neuro-Oncology》在线。

研究方法

研究者在体外通过跨上皮或内皮细胞电阻（TEER）和抗体弥散试验评估NEO100对细胞屏障通透性的影响。采用蛋白质印迹、微阵列分析和电子显微镜进行相关机制的研究。在小鼠模型中超声引导下向心脏内给于NEO100，然后静脉注射伊文氏蓝（Evan's blue）、甲氨蝶呤（Methotrexate，MTX）、检查点阻断抗体或嵌合抗原受体修饰T细胞（CAR-T），测定透过BBB的状况。

研究结果

研究结果显示，NEO100增加细胞屏障通透性。采用2mM NEO100处理MDCK1细胞转运屏障模型，可显著改变细胞屏障的完整性；1mM NEO100处理脑内皮细胞（EC）+星形胶质细胞，细胞屏障遭破坏（图1A）。使用TEER检测发现NEO100给药10min后，细胞屏障破坏明显，并在给药3h内保持开放状态（图1B），而在撤药18h后细胞屏障完全恢复（图1C）。用1mM NEO100处理0.5h后，脑内皮细胞膜通透性发生改变，作用持续6h，给药4h后细胞膜通透性达最大程度（图1D）。可见NEO100增加细胞质中紧密连接蛋白和辅助蛋白的水平，而降低细胞膜的水平（图1E）。

图1. NEO100增加细胞屏障通透性。A.测定不同浓度NEO100处理4h后MDCK1和来源于患者的脑内皮细胞（EC）+星形胶质细胞屏障的通透性。B.TEER检测用2mM NEO100处理MDCK1（左图）或1mM NEO100处理EC+星形胶质细胞（右图）后，细胞屏障通透性随时间的变化状况。C.用2mM NEO100处理MDCK1(左图）或1mM NEO100处理EC+星形胶质细胞（右图）3h后停用NEO100，并用TEER检测细胞屏障通透性恢复情况。D.柱状图显示HPLC测定EC上清液中残留的NEO100及其稳定的代谢产物浓度。E.Western blot检测显示细胞膜与细胞质中紧密连接蛋白（TJ）、辅助蛋白claudin-3、claudin-5、JAM、ZO-1和occludin水平。

IA注射NEO100开放BBB呈剂量依赖性，如NEO100注射剂量与脑组织中伊文氏蓝（EB，961 Da）浓度呈正相关（图2A-C）。而用甘露醇代替NEO100则不会出现EB外渗（图2A）。此外，IA注射NEO100可立即开放BBB，持续2-4h（图2D），说明IA注射NEO100能够迅速可逆地开放BBB。BBB恢复正常后，脑组织中外渗的EB最多残留7d（图2E）。透射电镜发现，脑血管腔周围紧密连接的超微结构发生改变，例如IA注射0.3% NEO100后，小鼠内皮细胞之间出现裂隙（图2F），说明IA注射NEO100可破坏细胞间连接介导BBB的开放。

图2. IA注射NEO100能够即刻、短暂、可逆地打开BBB。A.上、中和下三图各为IA注射NEO100、经静脉（IV）注射NEO100和IA注射甘露醇时的小鼠脑组织内EB含量。B.从前图到后图示，IA注射3%、0.3%、0.03%和0% NEO100时小鼠脑组织冠状位切片。C.检测脑室周围EB自发荧光。D.IA注射3% NEO100后，在指定时间点通过尾静脉注射2% EB，并在2h后，处死动物留取脑组织。E.从A图至H图各为正常小鼠、IA注射3% NEO100+IV注射2% EB后30min、120min、240min、1d、3d、5d和7d的小鼠脑组织图片。F.透射电镜显示，BBB超微结构发生改变，正常脑组织（左图）内皮细胞（EC）之间为紧密连接线，而IA注射NEO100后EC之间出现裂隙（右图）。

IA注射NEO100能够向大脑传递不可渗透BBB的治疗药物甲氨蝶呤。研究者分别用IA注射NEO100、经静脉（IV）注射甲氨蝶呤或IA注射NEO100+IV注射甲氨蝶呤处理实验动物2h后，发现IA注射NEO100+IV注射甲氨蝶呤动物组的脑组织和脑脊液（CSF）中，甲氨蝶呤的含量明显高于其它处理组（图3）。

图3. IA注射NEO100能够向大脑传递不可渗透BBB的治疗药物甲氨蝶呤。A.双光子显微镜检测甲氨蝶呤自发荧光，IA注射0.3% NEO100+IV注射MTX时，小鼠脑组织中可检测到甲氨蝶呤（白色）。B.HPLC测定血清、脑和CSF中甲氨蝶呤水平。

NEO100介导BBB开放促进抗PD-1抗体进入大脑。相比未处理或IV注射抗PD-1抗体，IA注射0.3% NEO100能够显著增加脑肿瘤区抗PD-1抗体的浓度；而在正常脑组织中未能检测到PD-1抗体，表现出对脑肿瘤组织有较高的特异性和亲和力。此外，相比未处理或IV注射抗PD-1抗体，IA注射0.3% NEO100能够显著增加脑肿瘤区CD8+T细胞的数量，说明IA注射NEO100不仅能够增加脑肿瘤中抗PD-1抗体的浓度，还可通过抗PD-1抗体重建肿瘤微环境中的免疫功能。

IA注射NEO100增加脑肿瘤区CAR-T细胞数量。研究者建立原发性CNS异种淋巴瘤颅内移植小鼠模型，分别用IV注射CAR-T细胞（5×106）或用IA注射0.3% NEO100+IV注射CAR-T细胞（5×106）处理。相比未处理和IV注射CAR-T细胞，IA注射0.3% NEO100显著增加脑肿瘤区CD3+CAR-T细胞数量，并且CD3+CAR-T细胞优先集中在脑肿瘤区，在正常脑组织中未检测到CD3+CAR-T细胞，表现出对脑肿瘤组织较高的特异性和亲和力（图4）。

图4. IA注射NEO100增加脑肿瘤内CAR-T细胞浸润数量。A.相比未处理或IV注射人CAR-T细胞，IA注射NEO100显著增加脑肿瘤区CD3+CAR-T细胞的数量。B.图示BBB的结构，包括EC、周细胞和星形胶质细胞足突，以及免疫球蛋白、白细胞（中性粒细胞，直径10-12μm；淋巴细胞，直径6-14μm）和红细胞（直径7.5μm）。

结论

该研究结果表明，IA注射NEO100能够安全、迅速、高效和可逆地打开BBB，促进甲氨蝶呤、抗PD-1抗体和CAR-T细胞进入CNS。因而，IA注射NEO100有望成为一种安全，应用广泛，向大脑传递不可渗透BBB的治疗药物的方法。

声明：脑医汇旗下神外资讯、神介资讯、脑医咨询所发表内容之知识产权为脑医汇及主办方、原作者等相关权利人所有。未经许可，禁止进行转载、摘编、复制、裁切、录制等。经许可授权使用，亦须注明来源。欢迎转发、分享。