摘要
细胞外间隙为细胞膜外相互连通的，充满组织液和基质的不规则特殊空间，是细胞赖以生存的微环境。脑细胞外间隙影响着神经系统的活动，并参与各种神经系统疾病的发生、发展。但是，长期以来脑细胞外间隙在各种神经系统疾病中的作用缺乏重视和深入研究。本课题团队在国内外率先开展对细胞外间隙的磁跟踪技术。细胞外间隙占据高级别胶质瘤近一半的容积特性，本文重点介绍细胞外间隙在脑胶质瘤中的变化规律及其在脑胶质瘤临床治疗中的应用，为临床探索脑胶质瘤的诊疗新方法提供参考。
脑胶质瘤是最常见的原发性恶性颅内肿瘤，发生率约为3~4/100000[1]。其中以胶质母细胞瘤（glioblastoma，GBM）的恶性程度最高[2]。目前，以显微外科手术结合放、化疗辅助治疗为主，但预后不良。文献报道，GBM患者的无进展生存期为7~8个月，中位生存期为15~18个月，5年生存率只有约10％[3-7]。脑胶质瘤预后不良的主要原因是瘤细胞以单个或成簇形式浸润性生长至周围脑组织[8]。因此，通过显微外科手术难以将其完全切除，术后肿瘤复发几乎成为必然[9-10]。细胞外间隙（extra cellular space，ECS）是脑胶质瘤细胞在脑组织中浸润性生长的关键部位。脑胶质瘤细胞在迁移过程中形态会发生变化，且与ECS相互作用，共同促进其发生侵袭和扩散[11]。ECS几何形状的变化不仅会影响肿瘤的侵袭，还会影响神经递质和抗肿瘤药物向肿瘤细胞的递送。因此，本文重点探讨ECS在脑胶质瘤发生、发展中的作用。
一、ECS的概念和研究方法
1.概念：ECS是细胞膜外由果冻状含水基质充满的特殊空间，包括细胞与细胞之间的间隙、血管与血管周围的空隙以及脑室和蛛网膜下腔。但是，通常将ECS等同于细胞与细胞之间的间隙。ECS的主要成分是由蛋白聚糖、透明质酸及各种小分子量连接蛋白组成的细胞外基质（extra cellular matrixc，ECM）。大脑的ECS是神经系统赖以生存和发挥功能的重要微环境，主要包含与脑脊液成分相似的组织液，且与脑室和蛛网膜下腔相通。
ECS的拓扑结构是一个高度连接的空间，其中每个元素通过多种途径相互连接。大脑ECS被描述为含有泡沫的水相结构[12]。1966年，Villegas和Fernández[13]首次测量了人大脑ECS，平均宽度为13.5nm；并认为大脑ECS的宽度可能会发生变化，还包含类似“湖泊”样的局部扩张[14-15]。但是，Horstmann首次尝试采用电镜测量人大脑的ECS时，发现该区域几乎不存在；考虑可能由于采用脱水、固定的方法制备电镜样品时引起细胞外液流失所致。诸多研究在改进电镜样品的制备方法后再结合放射性示踪法和实时离子电渗法检测ECS，发现大脑ECS实际约占健康者脑容积的20％[16-17]。
2.研究方法：目前，有诸多探索脑ECS超微结构的方法，其中较成熟且应用广泛的有：放射性示踪法[18]、集成光学成像法[19]及实时离子导入与压力引射法[20]；而电阻抗法[18]、光散射与透射法[21]、微透析法[22]、磁共振成像法[23]及荧光漂白恢复法[24]，由于机制尚不清楚，且与传统测量的结果差异较大，仍有待于进一步证实。上述方法均具有检测范围受限、不能实时活体检测等缺陷，大大制约了脑ECS的研究。
为了解决上述方法的不足，国内学者首次发明了磁示踪法，以磁共振成像仪作为检测平台，采用射频作为信号源，利用人工合成的光磁双模态分子作为探针，解决了脑深部ECS信号采集的技术难题，实现了活体脑ECS结构特征及其内组织液引流的实时三维动态可视化观察，为在全脑三维空间下研究ECS提供技术支持[23]，目前与杨军教授神经外科临床团队合作，进一步行脑胶质瘤的临床应用研究[25-27]。采用磁示踪法观察ECS主要有两个特征参数，分别为体积分数（α）和曲折度（λ）。α是ECS体积与组织总体积的比率，大脑ECS约占脑容积的20％，即α=0.2。λ描述了ECS可用于扩散空间的几何特性，即阻碍分子扩散因素的大小。ECS中诸如大分子、神经元及神经胶质细胞之间的障碍越多，ECS的曲折度越大，导致ECS中物质颗粒扩散速度越慢[28]。
3.作用：除了充当细胞间分子信号的传递通道外，ECS还具有许多重要作用。（1）ECS提供了类似于脑脊液的细胞外微环境，对于中枢神经系统中维持跨膜电活动离子通道的活性至关重要。同时还包含由蛋白聚糖和糖胺聚糖组成的基质[29]，其组成和密度均可随ECS结构的变化而变化[30]，但具体机制尚不清楚。（2）ECS也是葡萄糖和许多其他物质（如：生长因子）从血管到达脑细胞的重要通道[31]，同时也是很多药物递送的关键环节。例如通过鞘内给药[32]、透过血脑屏障给药[33-34]或置入缓释胶囊局部给药[35]时，ECS扩散起着至关重要的作用[36]。其中，药物包括右旋糖酐、血清白蛋白及合成聚合物等生物大分子，均已用于颅内药物递送领域[37]。目前，有学者研究带有标记的神经生长因子在正常脑组织中的扩散情况[38]。
二、脑胶质瘤的ECS
（一）体积分数
文献报道，尽管脑胶质瘤中细胞密集增多预示其ECS减少，但在电镜成像和放射性标记蔗糖灌注实验中，脑胶质瘤的ECS体积分数均有不同程度的增加[39]。目前，通过实时离子导入与压力引射法检测不同病理类型的胶质瘤发现，弥漫性星形细胞瘤（α=0.29±0.01）、胶质母细胞瘤（α=0.48±0.01）、毛细胞型星形细胞瘤（α=0.37±0.02）、室管膜瘤（α=0.39±0.01）及髓母细胞瘤（α=0.38±0.03）的ECS体积分数均显著增加，但少突胶质细胞瘤（α=0.23±0.01）的ECS体积分数增加不明显[40-41]。大多数高级别胶质瘤的ECS体积分数几乎可达到0.5。不同病理类型的胶质瘤ECS体积分数的增加程度与肿瘤的增殖活性呈正相关[40-41]。因此，肿瘤细胞的侵袭性除了取决于肿瘤细胞本身的增殖活性、黏附力及沿ECM迁移能力外，还取决于肿瘤是否有足够的ECS以供细胞迁移。
在非少突胶质瘤中，ECS增加常伴随细胞数量的增多。某些因素有助于ECS的扩张。首先，脑胶质瘤细胞之间的缝隙连接缺失可引起细胞间通讯减少[42]，从而导致肿瘤细胞的生理调节功能失稳态，细胞体积也随之减少，进而使ECS增加[43]；其次，目前已经证实在GBM细胞膜上存在结构异常的电压依赖性和配体依赖性氯离子通道[44]，使氯离子随水流向细胞外，从而减少肿瘤细胞体积，这是ECS促进肿瘤细胞迁移的重要因素之一。此外，由于兴奋性神经递质谷氨酸在脑胶质瘤细胞中不易被摄取，使得谷氨酸浓度异常升高，兴奋毒性作用最终引起神经元死亡，可能导致肿瘤与周围组织交界处的ECS体积增加[45]。少突胶质细胞瘤的ECS体积分数未显著增加，考虑主要与谷氨酰胺合成酶在少突胶质细胞中不表达有关[45]。
与世界卫生组织（WHO）Ⅱ级弥漫性星形细胞瘤相比，毛细胞型星形细胞瘤尽管病理级别低、生长慢，却有更高的ECS体积分数（α=0.37±0.02），可能由于微囊泡扩张ECS所致。光镜下可以观察到微囊泡内充满低密度组织液而无分子量较大的糖蛋白，也说明毛细胞型星形细胞瘤的曲折度较低。
（二）形状和曲折度
文献报道，高级别胶质瘤中ECS体积的增加与曲折度降低无关，而与ECS中阻碍小颗粒扩散的障碍物增加有关[40]。高级别胶质瘤内新形成的ECS会发生扩张，但不会维持空旷状态；且结构较正常脑组织复杂。文献报道，肿瘤内微血管增生和ECM的变化均能使肿瘤的ECS发生变化[40]。肿瘤细胞的密度和ECS曲折度之间并无显著相关性。曲折度可能仅受肿瘤内微血管增生的影响。研究表明，肿瘤细胞的分支交错形成网络是造成低级别胶质瘤经ECS扩散受阻的主 要原因。由于脑损伤后星形胶质细胞增生，大鼠的脑组织ECS曲折度也出现变化[28]。相比之下，高级别胶质瘤对其ECS曲折度的影响较小，曲折度增加的主要原因是ECM中产生了过量的糖蛋白所致[41]。但是，高级别胶质瘤细胞的迁移能力虽然增强，但ECS中阻碍扩散的因素实际上增加，考虑可能由于胶质瘤的细胞迁移和小分子扩散对ECS有不同的侧重点，ECS体积分数增加显著增强了粒子扩散和肿瘤细胞的迁移能力，而ECM中的大分子则同时阻碍了离子的扩散，但同时增强了细胞的迁移能力，因为ECM大分子为肿瘤细胞的黏附和迁移提供了底物。
总之，ECS的体积分数和扩散障碍均增加，可能会阻止颅内神经递质和治疗药物的扩散，从而为肿瘤细胞的迁移提供最适宜的环境，并通过其产生的金属蛋白酶促进胶质瘤细胞的侵袭[46]。即使在颅内压增高的情况下，大多数高级别胶质瘤仍然保持ECS的扩张状态，从而增加对周围正常脑组织的损伤[41]。
三、ECS在脑胶质瘤治疗中的应用
由于中枢神经系统中存在血脑屏障，口服或静脉给药均不能使药物直接进入中枢神经系统，或不能在颅内达到有效分布。药物治疗在中枢神经系统疾病中的应用受到极大限制[47]。因此，为解决这一难题，研究者开发出多种给药方法。其中，对流增强给药（convection enhanced delivery，CED）是一种极有效和安全给药方法。
20世纪90年代，CED技术首先由美国学者Edward提出[48]，被广泛应用于各种中枢神经系统疾病的治疗中。由于CED具有局部给药的特点，且脑胶质瘤通常为原位复发，因此应用CED技术可使抗癌药物直达肿瘤、术后瘤腔及瘤周组织。这样不仅可以对脑胶质瘤原发灶进行治疗，还可有效预防术后肿瘤复发。因此，关于CED的研究大多数集中在对高级别胶质瘤的治疗中[49-51]。诸多研究发现，采用CED方法将传统化疗药物应用于高级别胶质瘤患者，结果发现可明显改善其总生存期，减轻肿瘤负荷，同时可有效缓解常规给药途径所致的全身不良反应[52-54]。也有文献报道，将CED应用于弥漫内生型脑桥胶质瘤患者的治疗，结果发现肿瘤体积明显缩小，患者症状明显改善，且未出现明显不良反应[55-56]。
目前，随着纳米材料的发展，利用纳米微粒作为抗癌药物载体是CED的研究热点。例如，聚合物纳米微粒可以与多种化疗药物结合，并可有效地提高药物在颅内分布的均匀性和有效性。磁性纳米微粒也具有类似的优势，可结合具有生物活性的大分子和磁共振示踪剂，通过CED方式注入ECS内，从而提高对脑胶质瘤的治疗效果[57-59]。但是，应用CED治疗胶质瘤的效果目前仍存在争议[52]。有文献报道，胶质瘤患者手术切除情况、肿瘤残留量、CED导管置入位置及药物的个体化分布差异等诸多因素均会对患者的疗效产生影响[60]。此外，注药过程中出现的药物反流、气泡及药物分布不均等问题仍亟待解决。因此，该技术距离应用于临床仍需要很长的时间。
总之，随着科技的进步，以CED为代表的经ECS给药技术会不断发展和成熟，可为脑胶质瘤的精准治疗提供更为有效和安全的方法。
四、总结和展望
越来越多的研究证实，随着胶质瘤的进展，其ECS的结构和组分也处在动态变化中。在低级别胶质瘤中，肿瘤细胞的突起在略扩张的ECS内形成密集的网络。随着低级别胶质瘤进展到高级别胶质瘤，细胞逐渐失去体积的自我调节能力，导致细胞体积减少、ECS体积相对增加。高级别胶质瘤细胞会产生大量的肿瘤特异性ECSM组分，这些组分不仅起到维持ECS体积扩张的作用，而且还作为肿瘤细胞黏附和侵袭迁移的基质。此外，ECS的结构和组分的变化可能会阻碍神经递质和药物的扩散。
将治疗药物通过ECS途径输送至胶质瘤的新型给药方法已开始临床试验，其中肿瘤ECS的体积，形态曲折度及组分变化对治疗效果起着巨大影响。尽管，目前人们对ECS的认识还很表浅，但ECS占据高级别胶质瘤近一半的容积，对ECS的深入研究不但有助于从新角度来阐明脑胶质瘤的病理生理学机制，还可以为脑胶质瘤的诊疗提供新途径、新思路及新方法。因此，对脑胶质瘤ECS开展深入研究对于完善其治疗策略是至关重要的。
参考文献
