间充质干细胞来源的外泌体与创伤性脑损伤的研究进展 |【中华神外】2019年第12期“综述”

神外资讯【中华神外】专栏，每周发布一篇精选文章，今天刊登的是由杨永祥、孔垂广、贺晓生在《中华神经外科杂志》2019年第十二期“综述”上发表的“间充质干细胞来源的外泌体与创伤性脑损伤的研究进展”，欢迎阅读。

间充质干细胞来源的外泌体与创伤性脑损伤的研究进展

摘要

外泌体是细胞分泌的、直径为30～100nm的囊性小泡，其内含有蛋白质、脂类、mRNAs和miRNAs等多种分子。其中，来源于间充质细胞（MSCs）的外泌体以其对某些神经系统疾病具有干预和治疗潜能而备受关注。近期研究表明，将MSCs来源的外泌体注入创伤性脑损伤（TBI）动物体内具有减轻神经炎性反应、促进神经再生及恢复神经功能的作用。鉴于MSCs来源的外泌体具有体积微小、不能增殖、易保存及免疫原性低等诸多优点，可能成为一种治疗TBI的新策略。本文将对MSCs来源外泌体的生物学特性与功能进行阐述，并对其与TBI后神经炎性反应、神经再生及治疗前景的关系进行探讨。

外泌体是细胞通过内吞外排作用形成的由膜包裹的囊性小泡，直径为30～100 nm^[1]。外泌体通过内含的蛋白质、脂类、mRNAs及miRNAs等多种分子在细胞间进行信息传递并发挥生物学功能^[2]。外泌体在神经系统疾病中具有潜在的临床应用价值，包括：可作为临床诊断的生物标志物^[3]、具有低免疫原性、长半衰期及穿越血脑屏障的能力^[4]、可介导神经再生^[5]等。近年来，干细胞来源的外泌体被广泛应用于神经系统疾病的研究中，其中最常使用的是间充质细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）来源的外泌体。创伤性脑损伤(traumatic brain injury, TBI)是致死性和致残性的主要原因之一^[6]。诸多研究表明，MSCs来源的外泌体在减轻神经炎性反应、促进神经再生及改善神经功能方面具有重要作用^[7-13]。虽然有研究表明MSCs来源的外泌体有望成为一种治疗TBI的新策略，但具体机制仍不详。因此，本文通过总结有关MSCs来源外泌体与TBI研究的最新进展，以期探索其作为一种治疗TBI新方法的可能性。

一、外泌体概况

细胞外囊泡是一种新型的细胞间通讯介质，可由多种形式形成，如细胞膜脱落或通过囊腔融合后胞吐分泌^[14]。因此，细胞外囊泡可能存在不同的组成成分、功能及类型^[15]。近期研究发现，不同方式形成的细胞外囊泡在不同组织和体液的细胞外环境中可共存^[14]。外泌体是细胞外囊泡的亚型，主要通过溶酶体途径形成或来自细胞膜的多泡体融合释放^[4]；内含多种分子成分，主要包括与细胞类型相关的脂质、蛋白质及编码和非编码RNAs^[16]。

(一）外泌体的生物合成过程

外泌体可由各种类型的细胞通过内化蛋白质转运内吞的方式分泌，然后再被细胞膜内吞回收或分裂降解^[16-18]。生物合成过程经历早期、晚期内涵体及膜向内出芽形成腔内囊泡。晚期内涵体因包含腔内囊泡通常被称为多泡体，它们或与溶酶体融合并引导内容物降解，或与细胞膜融合并将腔内囊泡排出到细胞外环境中，这些细胞外囊泡被定义为外泌体^[19]。外泌体形成机制有ESCRT依赖性和非依赖性两种，前者通过将泛素化的膜蛋白隔离在胞内，进而诱导腔内囊泡内陷形成，可保护内容物；后者是将特殊内容物整合到外泌体中的替代途径，涉及脂质驱动机制^[20]和1-磷酸鞘氨醇受体依赖机制^[21]。

(二）外泌体内容物

包含细胞特异性脂类、蛋白质及编码和非编码RNAs的脂质双层膜囊泡[16]。其中，蛋白质包括：四跨膜蛋白家族（CD81、CD82、CD63及CD9）、参与ESCRT途径的多泡体生物合成相关蛋白(Alix、TSG101)、热休克蛋白(HCP/HSP 70和90)及膜运输与融合所需的蛋白质^[22-23]。脂质组合物通常存在于细胞外膜，其上有大量由胆固醇、神经酰胺、鞘磷脂与长饱和脂肪酸链构成的脂筏^[15]。编码和非编码RNAs，一般指mRNAs和miRNAs，mRNAs被受体细胞接受并翻译成蛋白质^[24]，但更多发挥监管功能而非翻译功能^[25]；有关miRNAs的研究最为广泛，多数情况下通过作用于mRNAs非翻译区的方式调控翻译过程，因此miRNAs可以改变受体细胞的表型和（或）生理特性，进而调节与增殖、分化及存活有关的细胞过程^[26]。外泌体内容物因其来源、细胞状态或所处环境的变化而变化。因此，外泌体可反映其来源细胞的功能状态，同时还可作为其细胞来源的参考指标。

二、MSCs来源的外泌体

MSCs来源的外泌体是目前最普遍使用的干细胞来源外泌体之一，已被广泛应用于神经系统疾病的研究中。MSCs是一种多能干细胞，因其具有自我更新能力和多向分化潜能而被应用于修复受损的间充质或外胚层组织（如神经组织）的研究中^[27-28]。MSCs介导神经再生主要通过其分泌的生物活性因子之一“外泌体”来实现^[29]。与其他来源（如骨髓、脐带血及脂肪等）比较，MSCs是外泌体的最主要释放者^[30]，形成机制和作用均大同小异，主要差异在于收集外泌体时采用的分离、鉴定及递送方式不完全相同。如骨髓来源的MSCs，最常用的分离方法为超高速离心或应用快速提取试剂盒，最常用的鉴定方法为蛋白质免疫印迹实验，而最常用的递送方式为皮下注射或静脉注射^[12]。脂肪组织来源的MSCs，最常用的分离方法为超高速离心，最常用的鉴定方法为电镜和蛋白质免疫印迹实验，最常用的递送方法为静脉注射^[9]。

外泌体的内容物成分与细胞的来源有关，因此MSCs来源的外泌体内容物有其自身特点。除普通的表面标志物外，MSCs来源的外泌体还包含特殊的膜结合蛋白如CD73、CD44及CD29^[31]。当MSCs来自不同的MSCs培养基时，其释放外泌体所含蛋白质的成分也会发生变化。RNAs如mRNAs和miRNAs同样被包裹在MSCs来源的外泌体中。大多数研究表明，MSCs来源的外泌体含有多种参与细胞间通信和能够改变受体细胞命运的miRNAs^[5,32-34]。外泌体分泌是一种高效的自适应机制，即环境变化可以影响外泌体的组成、生物合成及分泌。MSCs来源外泌体的轮廓也可通过预处理得到修饰。文献报道，与经过正常大鼠脑组织提取物处理后的MSCs比较，经过大脑中动脉闭塞大鼠脑组织提取物处理后的MSCs内miR-133b的含量及其释放的外泌体量显著增高^[5]。研究也表明，经过缺血预处理脑组织提取物干预后的MSCs来源外泌体中miR-22的水平升高^[35]。以上研究均提示，MSCs可以通过其分泌的外泌体与其周围环境互相提供反馈信息，即MSCs的周围环境可以改变其释放外泌体的内容物，外泌体也可以影响和改变MSCs的周围环境。

三、MSCs来源的外泌体与TBI

(一）MSCs来源的外泌体与TBI概述

以往有关TBI的动物实验和临床实践研究表明，MSCs干预有望成为TBI的有效治疗手段^[36-38]。最近研究发现，MSCs参与TBI后脑组织重塑和功能恢复是通过其释放的外泌体来实现的^[36,39]。新近研究也表明，MSCs来源的外泌体可以减轻TBI后神经炎性反应、促进神经和血管再生及改善神经功能^[11-13]。这些研究结果均提示，MSCs来源的外泌体可能比MSCs本身对TBI有更好的疗效。

(二）MSCs来源的外泌体与TBI后神经炎性反应

TBI后脑组织神经炎性反应反应的特点是胶质细胞活化、白细胞聚集及炎症介质如细胞因子和趋化因子的产生和释放^[40]。这些炎症介质不仅影响周围神经胶质细胞和神经元，而且还募集外周免疫细胞如中性粒细胞、巨噬细胞及淋巴细胞进入脑内。虽然上述由原发性损伤引起的内源性炎症反应旨在修复受损脑组织，但促炎因子的过度分泌通常成为TBI病理生理过程发展的重要驱动力。过度的神经炎性反应反应不仅可以启动原发性损伤如弥漫性轴索损伤、脑挫裂伤、颅内出血及脑肿胀^[41]，而且还可导致继发性TBI，如原发性损伤加重、渐进性神经退行性疾病及迟发性神经元死亡^[42]。因此，如何缓解TBI后急性神经炎性反应反应以及进一步建立有效的治疗策略是目前的研究热点。

最近两项研究证实，利用MSCs来源的外泌体处理TBI大鼠能显著减轻神经炎性反应，且能明显抑制GFAP+星形胶质细胞和CD68+小胶质细胞的活化^[11-12]。因为活化的星形胶质细胞和小胶质细胞在TBI后神经炎性反应的发生发展中起重要作用，所以MSCs来源外泌体的抑制作用可产生抗炎效果。这些研究表明，MSCs来源的外泌体有可能成为减轻TBI后神经炎性反应的新策略，它的优势在于体积微小、低免疫原性、具有跨血脑屏障和有效转运生物分子及与靶细胞相互作用的能力。但其具体细胞和分子机制目前仍不清楚。文献报道，外泌体内的miRNAs在改变受体细胞表型和生理特性的过程中发挥关键作用^[26]，所以它们可能成为未来的研究目标。此外，以往的研究表明MSCs来源的外泌体能够提高抗炎因子表达和降低促炎因子表达水平^[43]，进而通过抑制Toll样受体信号通路抑制巨噬细胞活化^[44]，以及通过抑制STAT3磷酸化途径抑制缺氧性炎症反应^[45]。这些发现可能会为有关MSCs来源的外泌体降低TBI后神经炎性反应的分子机制和信号通路研究提供有益的借鉴与启示。甚至MSCs来源外泌体的优势可能使它们成为一种理想的治疗TBI后神经炎性反应的药物载体。Sun等^[46]首先提出外泌体可以作为投递药物的工具，用于治疗神经炎性反应，且发现外泌体可以携带和传递姜黄素，并反过来增强其抗炎作用，包括提高复合物的稳定性和生物利用度以及提高LPS诱导败血症的生存率等。随后的研究也表明，外泌体能够将抗炎剂如姜黄素或JSI124传递到大脑，从而减轻LPS诱导的小鼠脑部炎症反应^[47]。

(三）MSCs来源的外泌体与TBI后神经再生

神经再生在TBI后神经功能恢复中起着重要作用，提高内源性神经干细胞的再生能力是改善TBI后功能预后的新策略^[48]。新近的研究表明，MSCs能有效促进TBI后神经再生，发挥作用的主要机制是旁分泌效应^[36]。MSCs来源的外泌体是MSCs旁分泌物的一种。研究表明，MSCs来源的外泌体能够促进TBI后神经再生^[11-13]，然而具体的细胞和分子机制尚不清楚。

目前，大多数专注于TBI后神经再生的研究均在探索新的策略以增强神经发生龛中新生神经元的增殖和存活能力。因此，在探索MSCs来源外泌体在TBI后神经再生过程中的作用之前，首先要明白外泌体与神经发生龛之间的关系。神经发生龛是一个储存有神经干细胞并由多种细胞组成的特殊微环境。神经发生龛内高效的细胞间通讯对神经再生过程有着至关重要的调控作用。外泌体是一种独特的细胞间通讯介质，其参与蛋白质、脂类、mRNAs和miRNAs在细胞间的转运^[26]。虽然神经发生龛内外泌体的生理和病理作用尚不清楚，但越来越多的证据支持外泌体具有调控神经发生龛的潜能。首先，神经干细胞和构成神经发生龛的细胞都可以释放外泌体或成为外泌体的靶细胞；其次，神经发生龛内细胞产生和释放的生物分子已被证实存在于外泌体中；第三，外泌体可以作为神经细胞间的信使，在血液、中枢神经系统和神经发生龛间进行信息传递^[7]。基于这些发现，神经发生龛将会成为探索MSCs来源的外泌体促进TBI后神经再生分子机制的研究目标。此外，miRNAs在神经再生的不同步骤中均发挥重要作用，而且外泌体内的miRNAs在改变受体细胞表型和生理特性的过程中发挥关键作用，所以它们也可以成为研究的突破点。新近的研究发现，将MSCs与缺血性脑组织提取物共培养可以显著提高其内含的miR-133b水平，并且MSCs可以通过外泌体将miR-133b转运到神经元和星形胶质细胞进一步促进轴突生长和脑功能的恢复^[5,49]。这一研究首次证实了MSCs来源的外泌体可以将miRNAs(miR-133b)转运至神经元和星形胶质细胞并调节轴突生长和促进神经功能恢复。MSCs来源的外泌体转运功能性miRNAs至神经细胞的能力可能也有益于其他神经系统疾病如TBI。此外，有研究报道，miR-124和miR-145可以被外泌体转运到星形胶质细胞和神经前体细胞^[50]。这些发现为探索MSCs来源外泌体促进TBI后神经再生的作用及机制研究提供了一些方法学上的借鉴和启示。

(四）MSCs来源的外泌体与TBI的治疗

目前，治疗TBI的策略主要有两种，一种是对于受损脑组织的神经保护治疗，以减少或防止继发性损伤和神经细胞死亡；另一种是神经修复治疗，旨在通过作用于整个中枢神经系统促进神经血管重塑和改善神经功能恢复^[51]。长期以来，有关TBI治疗的主要研究成果是神经保护药物的发展，但几乎所有的Ⅱ/Ⅲ期临床试验已经失败^[52]。因此探索新的治疗方法以改善TBI后神经功能恢复是非常必要的。

新近的研究表明，靶向多种实质细胞包括脑血管内皮细胞、神经干细胞及少突胶质前体细胞的修复治疗能够提高TBI后神经再生能力和改善功能预后^[53-54]。随后的研究发现，MSCs在临床实践中有希望成为TBI的有效治疗策略,且MSCs参与大脑重塑和功能恢复的主要机制是旁分泌作用^[36]。MSCs来源的外泌体是其旁分泌物的一种，其特点是不能增殖，与MSCs相比更易于保存、传输和低免疫原性。外泌体的多重优势如生物活性成分稳定、容易储存、较长的半衰期和保质期，以及穿过血脑屏障的能力使得MSCs治疗可能从细胞依赖转变为外泌体依赖^[55]。更重要的是，外泌体内复杂的蛋白质和遗传物质具有参与多种细胞生化过程的潜能，这大大有助于提高TBI的治疗效果。一些研究者甚至指出，外泌体依赖其体积微小、能够通过血脑屏障和作为药物递送工具等许多优势，可能成为一种治疗TBI的新手段^[56-57]。最新的研究表明，静脉注射MSCs来源的外泌体可以显著促进神经功能恢复^[11-13]，提示MSCs来源的外泌体可能成为治疗TBI的新策略。关于MSCs来源外泌体治疗TBI的作用机制，虽然Zhang等^[11]指出在促进神经血管再生和减少神经炎性反应方面发挥着重要作用，但是具体的细胞和分子机制尚不清楚。此外，因为外泌体内包含多种可以改变受体细胞表型和生理特性的miRNAs^[26]，所以将miRNAs和MSCs来源的外泌体相结合可能是治疗TBI的一个新方法。MSCs来源外泌体治疗TBI的另一个发展方向是基于其生理特性如低免疫原性、具有转运各种生物分子及与受体细胞相互作用的能力，以及对于某些疾病如TBI的个体化用药的能力使得其可能成为一种理想的药物载体。外泌体不仅可以携带治疗药物，也可以携带靶向脑内特定基因的siRNAs^[58]。一项研究表明，树突状细胞产生的外泌体可以转运siRNAs至神经元、少突胶质细胞和小胶质细胞并抑制靶基因的表达，同时装载siRNAs的外泌体可经静脉给药并沉默中枢神经系统中的基因表达^[56]。上述研究表明，MSCs来源的外泌体有可能作为一种非侵入性的干预方式将治疗药物转运至大脑，并进一步应用于TBI的治疗。

四、结论与展望

外泌体是最小的细胞外囊泡，含有蛋白质、脂质、mRNAs及miRNAs等生物活性分子，并在细胞间信息交流中发挥重要作用。MSCs来源的外泌体具有许多优点，有望成为治疗TBI的新策略。新近的研究表明，MSCs来源的外泌体在TBI大鼠模型中能够改善功能恢复、促进神经再生及抑制神经炎性反应。因为MSCs来源的外泌体干预TBI后所涉及的细胞和分子机制尚不清楚，所以笔者提出了一些设想：(1) miRNAs可能成为探索MSCs来源的外泌体抑制神经炎性反应反应和促进神经再生作用的研究目标；(2)神经发生龛可能成为探索MSCs来源外泌体促进神经再生作用的重要研究目标。此外，miRNAs和MSCs来源外泌体的结合可能是一种治疗TBI的新方法，MSCs来源的外泌体由于可以转运治疗介质如药物和siRNAs，因此有可能成为一种非侵入性的治疗TBI的方式。虽然目前的研究结果令人鼓舞，但这仅仅是一个了解MSCs来源外泌体作为TBI治疗策略的初始阶段。有关MSCs来源外泌体与TBI的研究将会越来越多，相关的细胞分子机制也将会逐渐清晰。

参考文献

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