颅底脊索瘤原发和局部复发阶段的病理学变化特点及其预后意义 |【中华神外】2019年第12期“临床论著” - 脑医汇 - 神外资讯

神外资讯【中华神外】专栏，每周发布一篇精选文章，今天刊登的是由王亮、田凯兵、马骏鹏、霍续磊、张俊廷、张力伟、吴震、李桂林、杜江在《中华神经外科杂志》2019年第十二期“临床论著”上发表的“颅底脊索瘤原发和局部复发阶段的病理学变化特点及其预后意义”，欢迎阅读。

颅底脊索瘤原发和局部复发阶段的病理学变化特点及其预后意义

摘要

目的：

探讨颅底脊索瘤在原发和局部复发阶段的临床病理学特点及变化趋势，进而分析其与患者预后的关系。

方法：

采用自身前后对照的方法，回顾性收集2005年2月至2014年12月首都医科大学附属北京天坛医院神经外科收治并经病理学确诊的38例(89例次)颅底脊索瘤原发及局部复发肿瘤的组织样本。苏木素-伊红染色后分析核异型性、核分裂、基质比例、坏死、骨质侵袭以及病理亚型等病理学特点；采用免疫组织化学染色检测p53、Ki-67、EGFR、VEGFR、TRAF6的表达水平，比较原发及局部复发颅底脊索瘤不同阶段病理指标的变化；采用单因素和多因素Cox回归分析原发肿瘤中各病理指标的特点对患者无进展生存期的影响；单因素Cox回归分析复发肿瘤中各病理指标的变化对患者总生存期的影响。

结果：

38例患者中，28例经典型脊索瘤复发后，其中有10例（35.7%）病理亚型转变为去分化型，而6例软骨型脊索瘤复发后均未转化为去分化型。有31.6%（12/38）的肿瘤复发后出现坏死；在73.5%（25/34）的原发肿瘤中TRAF6呈高表达；50.0%（19/38）的肿瘤复发后TRAF6表达强度下调；p53、EGFR在肿瘤复发过程中分别有42.1%（16/38）和39.5%（15/38）表达上调。单因素和多因素Cox回归分析结果显示，原发肿瘤中存在坏死（HR=7.1，95% CI：1.4～37.1，P=0.006）、去分化型（HR=3.9，95% CI：1.2～7.2，P=0.040）及TRAF6≥3级（HR=0.2，95% CI：0.1～0.5，P＜0.001）可影响患者的无进展生存期，其中TRAF6≥3级（HR=0.2，95% CI：0.1～0.5，P＜0.010）是患者无进展生存期的独立保护因素。上述病理指标的变化趋势对肿瘤复发患者总生存期的影响差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

结论：

经典型脊索瘤局部复发后可向恶性程度更高的去分化型发生恶性转化，未发现软骨型脊索瘤复发后发生恶性转化的情况。TRAF6随着肿瘤复发其表达强度逐渐减低，其在原发肿瘤中的高表达是患者无进展生存期的独立保护因素。

脊索瘤是罕见的恶性骨肿瘤，常好发于颅底和骶尾骨。颅底脊索瘤由于难以达到根治性切除，且对常规放疗敏感性较差，因此，原发肿瘤患者接受初始治疗后容易局部复发^[^1]。根据欧洲肿瘤内科协会和美国脊索瘤基金会2017年发布的共识^[2^]，脊索瘤的局部复发定义为原发肿瘤在接受手术和（或）放疗后，在同一部位出现的肿瘤复发或再生长和（或）肿瘤从原发部位向邻近部位持续性进展。

脊索瘤的亚型一般分为经典型、软骨样型或去分化型，前两型易于辨认，去分化型通常指出现异常增大的核、坏死、高增殖指数及较少的间质，具有肉瘤分化的脊索瘤^[3^]。笔者在之前的研究中发现，颅底脊索瘤局部复发后存在恶性程度升高以及病理亚型转化的现象^[4^]。关于这一现象发生概率的高低，目前鲜见相关报道。此外，该肿瘤的临床病理学特点及常见的免疫组织化学标志物在肿瘤原发、复发等不同阶段的表达强度、变化趋势及其与临床预后的关系亦鲜见报道，而这些对于进一步认识颅底脊索瘤的发生和复发具有重要意义。

为了进一步明确颅底脊索瘤原发及局部复发后的病理学特点、变化趋势及其与肿瘤患者无进展生存期（progression free survival，PFS）、总生存期（overall survival，OS）的关系，作者选取因肿瘤原发及局部复发在首都医科大学附属北京天坛医院神经外科接受2次及以上手术治疗的颅底脊索瘤患者，回顾性分析其在肿瘤初发、复发等疾病不同阶段的病理学特点及变化趋势，现将研究结果报道如下。

材料与方法

1.主要试剂及设备：包括鼠抗p53、Ki-67（美国Invitrogen公司），鼠抗表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）、血管内皮生长因子受体（vascular endothelial growth factor receptor, VEGFR）（美国Sigma-Aldrich公司），兔抗肿瘤坏死因子受体相关因子6（tumour-necrosis factor receptor associated factor 6, TRAF6）（英国Abcam公司），数字信号采集分析系统（德国Zeiss公司 E600）。

2.临床资料：共纳入38例患者。纳入标准：（1）2005年2月至2014年12月首都医科大学附属北京天坛医院神经外科收治的、并经病理确诊的颅底脊索瘤患者；（2）保存因肿瘤复发而采取手术治疗获得的2批次及以上的组织病理标本；（3）患者的临床、影像学、随访资料完整。回顾性分析这组患者的性别、发病年龄、病变体积、切除程度、辅助放疗与否、肿瘤进展时间、患者死亡时间等。38例患者中，男18例，女20例；中位就诊年龄为40岁（15～66岁）。如图1所示，共纳入标本89例次（平均2.3次/例），其中34例（89.5%）为原发肿瘤标本，37例（97.3%）为第1次复发的肿瘤标本，14例（36.8%）为第2次复发的肿瘤标本，4例（10.5%）为第3次复发的肿瘤标本。

图1. 38例肿瘤按照原发，第1、2、3次复发顺序（从左至右）排列的免疫组织化学标志物表达强度示意图（0〜4代表表达强度；EGFR为血管内皮生长因子受体，VEGFR为血管内皮生长因子受体，TRAF6为抗肿瘤坏死因子受体相关因子6，空白格表示数据缺失或不存在，左侧数字代表例数）

3.标本采集：本研究纳入的颅底脊索瘤标本均为术中获得的新鲜组织标本，取材后30min内浸泡于40%甲醛水溶液中，48h后脱水、石蜡包埋，制作石蜡切片（厚度为5μm）。

4.苏木素-伊红（HE）染色、免疫组织化学染色方法：烤片1h，切片常规脱蜡入水（蒸馏水），3% H₂O₂避光，室温放置10min灭活内源性过氧化物酶，1×PBS洗涤2次，pH 8.0 EDTA抗原修复液高压锅抗原修复2min，自然冷却至室温，1×PBS洗涤3次，滴加p53、Ki-67、EGFR、VEGFR及TRAF6一抗，1∶200稀释，孵育湿盒4℃，12h，取出后放至室温，1×PBS洗涤3次；加迈新二抗（Max Vision TMHRP试剂盒，鼠/兔），室温孵育0.5h；1×PBS洗涤3次；DAB显色；蒸馏水终止反应，苏木素染核，清洗后1%盐酸分化，1%氨水返蓝。梯度乙醇脱水，二甲苯透明；中性树脂封片。

5.病理学结果的判定与分类：由2名高年资神经病理科医生对染色切片进行判读。对照HE染色图片鉴别肿瘤组织，记录患者的病理特征，包括细胞核异型性比例（分为≤5%组或＞5%组）、核分裂比例（分为<1/10 HP组或≥1/10 HP组）、基质比例（分为≥2%组或＜2%组）、坏死（分为有或无）、骨质侵袭（分为有或无）、病理类型［根据2013年世界卫生组织（WHO）的标准，分为经典型（28例）、软骨型（6例）、去分化型（4例）（或称癌样型）3组］。

免疫组织化学染色结果在400倍镜下进行阳性率判读。p53及Ki-67为核抗原阳性，采用计数法，每个视野连续计数100个细胞的阳性细胞百分比，取3个视野的算术平均值。其中p53分为＜25%组或≥25%组；Ki-67分为＜7%组或≥7%组。在对p53和Ki-67进行归类分析时，0%为阴性，记为0级；1%～10%记为1级；11%～30%记为2级；31%～60%记为3级；＞60%记为4级。EGFR、VEGFR、TRAF6采用着色细胞数加着色浓度的标准进行评级，0级为阴性，不着色；1级为着色细胞，占比为1%～10%，呈浅黄色；2级占比为11%～30%，呈黄色；3级占比为31%～60%，呈棕黄色；4级为着色细胞，占比＞60%，呈深褐色。

以入组患者在本研究中的第1次病理结果为参考基线，如其在后续复发阶段病理特征的分类（包括核异型性比例、核分裂比例、基质比例、坏死、骨质侵袭、病理亚型）中发生归属类别的变化，或其免疫组织化学标志物（p53、Ki-67、EGFR、VEGFR、TRAF6）染色强度分级发生至少1级上调或下调，将其划归为上/下调组，未发生病理特征类别或免疫组织化学标志物染色级别变化的划归为稳定组。

6.统计学方法：采用SPSS 20.0软件进行统计学分析。服从正态分布的计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用t检验或方差分析；不服从正态分布的计量资料采用中位数（M）和范围或上、下四分位数（P₂₅，P₇₅）表示，组间比较采用秩和检验。计数资料采用例数和百分率或构成比表示，组间比较采用Fisher精确检验。采用Kaplan-Meier法计算原发、不同复发肿瘤患者的PFS和OS。采用单因素Cox回归分析原发肿瘤患者不同病理学指标和免疫组织化学标志物染色强度的分级特点对PFS的影响，再将单因素分析中P＜0.05的相关因素纳入Cox多因素回归分析。单因素Cox回归分析复发肿瘤的病理学指标上/下调对OS的影响。P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1.原发及局部复发患者的生存情况（表1）：随着复发次数的增加，病变体积呈逐渐增大的趋势，而切除程度呈逐渐下降的趋势。34例原发肿瘤患者的中位OS为120.0个月（95% CI：69.3～170.7），中位PFS为32.8个月（95% CI：23.8～41.7）；37例肿瘤第1次复发患者的中位PFS为21.0个月（95% CI：15.3～26.8），14例第2次复发患者的中位PFS为16.7个月（95% CI：7.7～25.6），即随着肿瘤复发次数的增加，患者的PFS也呈逐渐缩短的趋势。

注：“－”表示无此数据。

图2. 原发及局部复发脊索瘤HE、TRAF6及EGFR染色结果。A.第1次手术后标本显示为经典型脊索瘤，肿瘤细胞呈空泡状或嗜伊红，呈片状、条索状分布于黏液样间质中（HE染色×200）；B.第3次手术后标本显示为去分化型脊索瘤，肿瘤细胞呈片状分布，间质稀少，核异型明显，并可见点灶坏死（HE染色×200）；C.TRAF6染色结果（免疫组织化学EnVision法染色×200），第1次手术后标本显示强阳性；D.第2次手术后标本TRAF6染色显示阳性（免疫组织化学EnVision法染色×200）；E.第3次手术后标本TRAF6染色显示阴性（免疫组织化学EnVision法染色×200）；F.EGFR染色结果（免疫组织化学EnVision法染色×200），第1次手术后标本显示阴性；G.第2次手术后标本EGFR染色显示阳性（免疫组织化学EnVision法染色×200）（TRAF6为抗肿瘤坏死因子受体相关因子6，EGFR为血管内皮生长因子受体）

2.病理学特点及变化趋势：（1）经典型脊索瘤复发后有向去分化型转化的趋势(图2A，B)，本组有35.7%（10/28）的经典型脊索瘤复发后病理亚型转变为去分化型，而6例软骨型脊索瘤复发后均未发生向去分化型转化，两者比较差异无统计学意义（P=0.148）。（2）在其他病理特征中，坏死伴随肿瘤复发变化最显著，有31.6%（12/38）的肿瘤在复发后出现坏死；骨质侵袭则是变化最不明显的病理特征，本组仅15.8%（6/38）的患者在肿瘤复发后出现骨性侵袭。（3）免疫组织化学标志物染色强度随肿瘤复发的变化情况：①相较于本研究纳入的其他标志物，TRAF6是原发肿瘤中表达最强，且复发后变化（表达下调）比例最大的指标(图1)。在肿瘤原发阶段，有73.5%（25/34）的肿瘤TRAF6呈高表达（表达强度≥3级）；随着肿瘤局部复发，有50.0%（19/38）的肿瘤TRAF6表达强度出现下调(图2C～E)，仅有7.9%（3/38）的肿瘤TRAF6的表达强度出现上调。②VEGFR在原发肿瘤中有58.8%（20/34）呈高表达，在复发肿瘤中分别各有23.7%（9/38）的VEGFR表达强度上调及下调。③其余3种标志物表达特点及变化趋势一致。p53在肿瘤复发过程中有42.1%（16/38）表达上调；Ki-67有26.3%（10/38）肿瘤复发后表达上调；EGFR在原发肿瘤中只有20.6%（7/34）呈高表达（表达强度≥2级），但随着肿瘤复发，有39.5%（15/38）出现EGFR表达上调(图2F，G)。

3.原发肿瘤的病理指标对患者PFS的影响因素分析结果（表2）：单因素Cox回归分析结果显示，存在坏死（P=0.006）、去分化型（P=0.040）及TRAF6≥3级（P＜0.001）分别与患者的PFS直接相关；将上述3项指标纳入多因素Cox回归分析发现，仅TRAF6≥3级（P＜0.010）是患者PFS的独立保护因素。

注：EGFR为表皮生长因子受体，VEGFR为血管内皮生长因子受体，TRAF6为抗肿瘤坏死因子受体相关因子6，“-”样本量不足未行统计学分析。

4.复发肿瘤的病理指标（上/下调）对患者OS的影响因素分析结果（表3）：单因素Cox回归分析结果显示，各项病理学指标的变化趋势对OS的影响差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

注：EGFR为表皮生长因子受体，VEGFR为血管内皮生长因子受体，TRAF6为抗肿瘤坏死因子受体相关因子6。

讨论

本研究通过自身前后对照的方法，比较颅底脊索瘤在疾病发展不同阶段的病理学主要指标、免疫组织化学标志物的表达水平，并与临床预后相结合，旨在进一步深入了解该肿瘤原发、复发等不同阶段的临床病理学特点及其变化趋势，评价上述病理指标在预后评估方面的价值，并对探讨颅底脊索瘤发生、发展机制提供重要的线索。

目前，颅底脊索瘤的临床病理学特点及免疫组织化学标志物的表达水平对于肿瘤复发的预测价值尚存争议。为了规避入组例数不足造成的偏倚，Tauzie`de-Espariat等^[3^]回顾性分析了111例原发颅底脊索瘤（含颅底及骶尾部）的临床病理学特点与预后的相关性，发现去分化型、核异型性、核分裂、Ki-67及p53与患者的PFS显著相关。

本研究在确定观察指标时，既参考了国内外的大宗病例报道^[3-7^]，又考虑到观察指标评估量化的可行性，包括未把出血、纤维间隔、炎细胞浸润等指标纳入本研究；还基于本研究团队的前期工作基础，例如在多例颅底脊索瘤患者的全外显子组测序中均发现TRAF6基因的上游调控基因存在突变（具体结果另撰文），因此，将TRAF6表达水平及其变化纳入本研究中。

在本研究中，有以下结果值得注意：第一，通过本研究结果证实，经典型颅底脊索瘤在肿瘤复发后可能向恶性程度更高的去分化型发生恶性转化，而未发现软骨型脊索瘤复发后发生恶性转化的情况。本研究仅能证实这一现象的存在，无法说明其发生机制与脑膜瘤的恶性转化类似^[8^]，究竟哪些基因驱动恶性转化的出现，仍有待于进一步深入探究。第二，本研究首次发现原发肿瘤组织中TRAF6高表达是患者PFS的独立保护因素，且随着肿瘤的复发，TRAF6的表达强度呈逐渐下降的趋势。肿瘤坏死因子受体（tumor necrosis factor receptor，TNFR）相关因子是一类肿瘤坏死因子受体介导的信号通路中的转导分子，其参与调节受体配体复合物在细胞中的定位；也参与调控信号通路中关键蛋白的降解与活化^[9^]。其中TRAF6有较为独特的作用，可同时作为TNFR超家族和Toll样/白细胞介素1受体（Toll/IL-1 receptor，TIR）的超家族重要接头分子。人TRAF6基因定位于11p13，编码的蛋白质为511个氨基酸残基，相对分子量为60kD，广泛分布于脑、肝脏、肺、骨骼肌、肾等组织中，心、脾、睾丸也有少量表达^[^10]。TRAF6几乎在所有报道过的肿瘤细胞株中均存在表达，并可调控肿瘤的恶性行为^[^11]。既往研究表明，多数肿瘤中TRAF6起到促肿瘤作用，其过表达可诱导如胶质母细胞瘤、头颈部癌症等肿瘤的发生，抑制其表达可明显阻止肿瘤生长和肿瘤血管生成^[^12]。但本研究发现,在颅底脊索瘤的进展中TRAF6似乎发挥着相反的作用，推测这可能与TRAF6在成骨细胞中的抑制作用较为一致有关，其具体机制有赖于细胞学、基因组层面的深入研究。第三，本研究发现上述病理学特征的变化，包括病理亚型的转化、坏死、核分裂的增加以及免疫组织化学标志物的变化（包括TRAF6表达水平下调、p53、Ki-67及EGFR表达水平的提升）均对患者的OS无显著影响，这可能与本研究未把治疗措施作为观察指标纳入分析有关；另一方面也可能与入组的病例数有限且随访时间较短有关。如果病例数量、随访时间充足，上述因素中可能存在对患者的OS产生影响的关键因素。

本研究的局限性包括：(1）受到研究方法的限制，本研究对观察指标多采用半定量或定性分析，在一定程度上限制了本研究结果的精确程度。(2）尽管本研究在观察指标的选择上经过多方面考虑，由于时效性等原因，仍不可避免遗漏一些重要的指标，特别是免疫组织化学标志物。比如近期有研究表明，对于复发的低分化肿瘤，存在整合酶相互作用分子1（INI-1）表达缺失的患者预后更差^[2^]。这些均有赖于今后工作中进一步完善。

参考文献