脑脊液活检在中枢神经系统肿瘤诊治中的应用

美国约翰霍普金斯大学医学院的Austin K Mattox等在2019年12月的《Neuro-Oncology》杂志发表文章，阐述脑脊液活检基因改变、表观遗传学表现和蛋白质候选物对CNS肿瘤诊治的意义。

——摘自文章章节

【Ref: Mattox AK, et al. Neuro Oncol. 2019 Dec 17;21(12):1509-1518. doi: 10.1093/neuonc/noz156.】

研究背景

脑脊液（CSF）的“液体活检”可作为中枢神经系统（CNS）恶性肿瘤微创诊断和治疗监测的有效途径。检测脑脊液中的游离核酸和生物标志蛋白为CNS肿瘤的术前诊断、选择靶向治疗和早期发现肿瘤复发奠定基础。美国约翰霍普金斯大学医学院的Austin K Mattox等在2019年12月的《Neuro-Oncology》杂志发表文章，阐述脑脊液活检基因改变、表观遗传学表现和蛋白质候选物对CNS肿瘤诊治的意义。

研究方法

“液体活检”技术利用二代测序（NGS）、质谱（MS）及酶联免疫吸附试验（Elisa）检测脑脊液中游离的无细胞循环核酸DNA和RNA（cell-free circulating nucleic acids，cfDNA和cfRNA）及脑脊液蛋白，获取基因突变、RNA/miRNA表达谱、差异性甲基化区域（DMR）以及蛋白质表达谱。获得多时间点的标本对肿瘤进行初步诊断，有助于评估治疗反应和肿瘤演变。

研究结果

cfDNA的基因突变：含有典型癌基因和抑癌基因突变的cfDNA来源于肿瘤本身，包含外显子、内含子和线粒体DNA，其半衰期相对较短，因此是研究肿瘤动态变化的理想对象。在脑脊液中的突变与原发肿瘤中的突变高度一致，高级别肿瘤比低级别肿瘤的脑脊液更容易检测到突变，而且突变水平更高。相比较，肿瘤大小似乎不能预测突变或突变水平。在脑脊液和血浆中突变的cfDNA浓度比值与肿瘤负荷相关。由于脑肿瘤与脑脊液相毗邻，提供从脑脊液中检测肿瘤源性DNA（tDNA）的条件。通过CSF-tDNA的活检用以诊断和监测CNS肿瘤。检测CSF-tDNA可识别脑转移瘤，反映其临床进程和预测肿瘤复发。检测CSF-tDNA突变还能确定肿瘤对辅助治疗的敏感性。连续的脑脊液活检可以追踪脑肿瘤的进展。随着脑脊液采集间隔时间的延长，编码生长因子信号通路基因的连续液体活检，可能改变基因突变的多样性，特异性也将下降。

cfRNA的表达变化：循环RNA作为cfDNA的替代物有很好的应用前景。cfRNA由循环信使RNA（mRNA）和微小核糖核酸（microRNA，miRNA）组成。mRNA能够编码蛋白质，miRNA能够靶向某个mRNA导致其降解或翻译抑制。RT-PCR、ddPCR、芯片或RNA测序可以明确目标基因表达水平。前两者高效直接，成本低廉，但一次只能分析一到两个基因；后两者一次能够分析成百上千个基因。RNA测序可以更好地了解标本的RNA表达谱，但耗时、昂贵。循环miRNA可区分原发性CNS恶性肿瘤和脑转移瘤。mir-15b和mir-21是胶质瘤的特异性miRNA；mir-10b和mir-2155在胶质母细胞瘤（GBM）患者脑脊液中十分丰富；mir-19、mir-21和mir-92a三者是原发性CNS淋巴瘤的诊断指标；miRNA-200变异体具有脑转移瘤的特异性。

cfDNA甲基化改变：表观遗传失调是肿瘤的典型特征之一。肿瘤细胞整体上低甲基化，位于抑癌基因的启动子或其它调控元件附近的CPG岛显示不同程度的高甲基化。胞嘧啶甲基化增加产生异染色质区，DNA与组蛋白结合更紧密，无法进行转录。高甲基化导致包括抑癌基因在内的基因蛋白表达水平降低。胶质瘤中最常见编码O6甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶（MGMT）基因的启动子甲基化，可作为替莫唑胺治疗反应的阳性预测因子。cfDNA甲基化状态与原发肿瘤高度一致。同时研究cfDNA的突变和异常启动子甲基化，比单独检测一种生物标志物更加敏感。

循环蛋白水平改变：CNS肿瘤向脑脊液分泌或释放的蛋白质可通过质谱（MS）或ELISA等技术检测。质谱法能够从同一标本中检测出大量不同蛋白质，但技术要求高，价格昂贵。ELISA相对便宜，操作简单，但仅限于鉴定某些蛋白质。脑脊液中蛋白质升高可能是肿瘤本身、炎症或其它疾病引起。鉴定特异性标志蛋白更具挑战性。最重要的特异性脑脊液蛋白是颅内恶性生殖细胞肿瘤的相关蛋白，即β-人绒毛膜促性腺激素（BHCG）和甲胎蛋白（AFP）；在脑脊液中明显升高时，有助于恶性生殖细胞肿瘤的诊断、治疗反应的监测和复发的预测；对于胶质瘤，Shen等确定19种在脑脊液中表达上调的蛋白质；KHuja及其同事筛选出B2M、SPARC1和VEGFB78等；Sampath等发现VEGF在高级别星形细胞瘤中显著高表达；GBM患者脑脊液中α-1-抗糜蛋白酶、骨桥蛋白、转氨酶和N-末端白蛋白残基升高；蛋白质分析可帮助诊断和监测儿童髓母细胞瘤，Rajagopal等发现其脑脊液中前列腺素D2合成酶水平比正常人低6倍。

生物标志物的局限性：游离核酸和蛋白质具有强大的应用潜力，但实验室中发现的生物标志物很少能够应用于临床，主要障碍可能是相似研究之间的低重复性。此外，生物标本必须妥善保存，避免反复冻融，以防止降解。测序技术局限性也阻碍鉴定游离核酸中少见的突变和甲基化改变。临床上颅内压升高是腰椎穿刺获取脑脊液的重要禁忌证。

结论

最后作者总结，采集脑脊液具有微创性，可提供CNS肿瘤的遗传基因、表观遗传改变和蛋白质组学状态的图谱，对脑肿瘤进行初步诊断、预测治疗反应和跟踪肿瘤复发。未来血液检测可能在CNS肿瘤的诊断和治疗中发挥作用，然而血脑屏障可能限制在血液中识别生物标志物。目前来看，髓母细胞瘤和高级别胶质瘤患者是最好的研究人群，这些肿瘤在突变频率、CPG岛甲基化状态和蛋白质表达方面的变化最显著。多时间点收集脑脊液是十分必要的，常规脑脊液取样已成为一些CNS肿瘤标准治疗的一部分；开拓脑脊液诊断技术是现有实践的逻辑延伸，但需要良好的前瞻性协作研究。